研究背景与目的免疫系统是机体参与内外环境相互作用、相互调节的重要系统。正常免疫系统可以识别“自我”与“非我”,对异源性抗原产生免疫反应,对自身抗原则耐受,这对于机体维持自身内环境稳态有着重要的作用,既可以消除致病原,又不至于过强损伤自身组织器官。机体内的免疫系统内存在着正负调控机制,既可引起炎症反应,同时不损害自身组织器官。机体的炎症免疫应答,是属于生物学里经典的正反应调控机制。从抗原的识别、呈递、免疫细胞的激活以及免疫细胞的免疫反应、补体系统等均存在信息放大的生学特征。同时,系统内还存在负调控机制,其涉及到免疫细胞的激活,抗体、补体及细胞因子的激活等过程,以防止反应过强损伤自身组织器官。我们所熟知的免疫抑制性细胞因子IL-10、TGF-β等均属于此类范畴。近几年随着分子免疫学的发展,对免疫细胞的分类及识别有了更深的认识,现在认为机体内除了具有引起免疫反应,造成免疫杀伤作用的免疫细胞外,还存在抑制免疫反应的免疫调节细胞。骨髓来源的抑制性细胞(Myeloid-derived Suppressor Cells, MDSCs)和调节性T细胞(Regulatory T cells, Tregs)是体内两种主要的免疫抑制性细胞。在肿瘤以及自身免疫性疾病患者体内这两种细胞参与了重要的免疫调控作用,影响疾病的发生发展以及预后。除去自身系统内的调节,免疫系统同时还受到机体其他系统的调控,目前有学者提出了神经精神-内分泌-免疫功能轴的概念。神经精神、内分泌、免疫是机体三大调控系统,除在各自系统内调控应对机体内外环境的变化外,他们之间还着相互调节,影响对方的调节功能’。神经精神-内分泌-免疫系统是机体内最大的调控系统,是机体与外界环境的主要反应系统。它涉及到神经、内分泌以及免疫三大系统。在此,我们主要研究的是前二者对于免疫系统的影响。神经系统各神经元通过分泌各种神经细胞因子以及直接电生理作用,传递生物信息,调节其下游的功能。而其分泌的神经细胞因子部分被证明与细胞因子有类似的结构,且可以作用于细胞因子受体,从而介导免疫作用。同样,内分泌系统通过分泌多种激素影响免疫系统功能,最为人们所熟知的是应激状态下皮质激素对于免疫系统的抑制作用。近些年,由于对于免疫机制研究的深入,许多人开始关注性激素对于免疫系统的作用,尤其是在自身免疫性疾病、肿瘤、创伤患者以及器官移植后患者免疫功能的变化等方面。从一个完整的机体方面,外环境变化后,通过影响神经精神以及内分泌系统的影响,从而达到对于机体免疫系统的影响,共同应对环境的变化。自身免疫性肝炎是一种常见的自身免疫性疾病,其发病多为隐匿,进行性发展,其临床表现为血清转氨酶升高、自身抗体阳性、肝脏淋巴细胞浸润,后期肝小叶重塑,发展为肝硬化,这是欧美国家造成肝硬化的主要病因之一。目前对于该病的机制并不清楚,临床已缺乏有效地治疗药物,肝硬化终末期,多需要人工肝移植。同其他自身免疫性疾病类似,自身免疫性肝炎的发生有明显的性别差异,男女比例通常为1：4,且在女性患者中,其发生有明显的年龄依赖性。该病在女性有二个主要的发病高峰,18岁以前或者40岁绝经以后,有学者认为这与不同年龄层女性体内性激素的水平变化有关系。关于雌激素与自身免疫性疾病的关系,目前并没有得到统一的定论。许久之前,就有学者发现发现在大部分自身免疫性疾病上,女性似乎较男性更易患自身免疫性疾病,但是其具体的机制并不是十分清楚。有学者发现,女性较男性更易接种疫苗,女性的免疫反应似乎较男性要强,这似乎可以解释女性发病率较高的问题。但是,同时,有人发现许多女性患者如类风湿性关节炎、多发硬化的患者,在怀孕后症状多有好转,而生产后,多有复发,说明一定较高水平的雌激素对于自身免疫性疾病有保护作用。但是,系统性红斑狼疮的患者,怀孕后多有加重,与上诉结论矛盾。近几年又有许多关于雌激素对于自身免疫性疾病的作用,但是,目前其与自身免疫性肝炎的关系,目前仍不清楚。雌激素对于不同自身免疫性疾病可能作用不同,这可能与自身免疫性疾病的发生机制有关。不同的类型的自身免疫性疾病介导其发生的机制不同。目前,有许多的学者关注于,早期抗原呈递的过程。免疫反应的发生,多是从抗原的呈递开始,经过树突状细胞、巨噬细胞处理后呈递给CD4+T淋巴细胞,T淋巴细胞通过表面的TCR以及抗原识别位点,识别抗原,激活辅助T淋巴细胞,促使其向不同辅助T细胞亚型分化,通过分泌细胞因子或者细胞间相互作用,激活下游的B细胞产生抗体介导体液免疫,或者CD8+T细胞介导细胞免疫。不同种类的自身免疫性疾病,其自身的抗体呈递方式亦不同。目前认为多发性硬化、自身免疫性肝炎以及类风湿性关节炎的患者,主要是由Thl介导的免疫反应导致的,而系统性红斑狼疮患者,则被认为主要是由Th2介导的免疫反应所致。雌激素在体外,被发现可以抑制Thl介导的免疫反应,但对于Th2介导的反应则有加强的作用。所以者不难理解,怀孕期间随着机体内雌激素水平的升高,Thl多发硬化、类风湿性关节患者症状好转,但是系统性红斑狼疮的患者症状反而有加重的趋势。己烯雌酚(diethylstilbestrol,DES)是一种人工合成的非甾体类雌激素类似物(synthetic)。其结构类似于雌二醇,进入机体后可以结合雌激素受体,发挥类似于雌二醇的作用,早期被用于替代雌二醇以缓解孕期反应,防止流产以及激素平衡失调引起的功能性出血、闭经等。近些年发现,DES作为雌二醇的类似物,可以替代雌激素的作用,补充体内雌激素的不足或者迅速降低引起的一系列症状。目前,在临床上发现,DES在围绝经期以及绝经后期妇女骨质疏松上的疗效明显,同其他雌激素类被认为是治疗骨质疏松最有效的药物,被广泛应用于中老年女性。另外,对于雌激素敏感的前列腺癌患者,DES可以抑制前列腺癌的发生与转移,达到化学辅助治疗的作用。目前临床上DES仍旧用于晚期前列腺癌、乳腺癌、闭经以及终止妊娠引产等。本课题的研究目的是探讨己烯雌酚,一种人工合成的非甾体类雌激素,对T细胞介导的自身免疫性肝炎的保护作用,希望为该疾病的机制探讨和临床诊治提供新思路。试验方法与结果首先,探讨的是乙烯雌酚(Diethylstilbestrol,DES)在体外对于成熟T细胞增殖的影响。取出雌性成年C57B/L6野生型小鼠脾脏,提取脾脏淋巴细胞后,在96孔板内培养,2.5ug/mL刀豆蛋白A(Concanavalin A,conA)处理活化T淋巴细胞,加入不同剂量DES,37℃,5%CO2,孵箱内共同培养24小时或48小时,最后的8小时加入3H-thymindine2ci/well,共同培养,结果表明在DES等于或高于20uM DES浓度时,可明显抑制2.5ug/mL conA诱导的淋巴细胞增殖。这个实验说明DES在体外特定的浓度下可以抑制模拟炎症发生的淋巴细胞的增殖作用,从侧面反应DES对机体免疫反应可能具有抑制作用,对于炎症、自身免疫性疾病以及移植后排斥的患者可能具有潜在的药用价值。其次,我们开始体内试验。我们选择的是conA诱导的小鼠急性自身免疫性肝炎模型。conA作为一种分裂原刺激物,给注射动物后可以引起动物的T细胞明显增殖,从而被用来模拟体内炎症反应。腹腔注射conA可以诱导自发性腹膜炎,静脉单独注射或者加用D-gal可向肝脏炎症方向诱导,表现为肝脏淋巴细胞浸润、肝组织损伤、转氨酶升高等肝炎症状,由于其早期主要的浸润细胞是T淋巴细胞以及NK细胞,所以被认为是T细胞介导的肝炎,是较为成熟和稳定的自身免疫性肝炎模型。我们选用的动物仍然是雌性成年C57B/L6野生型小鼠。实验分为四组,未处理对照组(Naive)、对照肝炎组(Vehicle,Veh)、 DES治疗组(DES treatment)以及DES单独处理组(DES only),每组5只小鼠。治疗组以及DES单独组对于小鼠进行DES预处理,诱导前第1、2天皮下注射DES(溶于玉米油内),对照肝炎组注射等体积玉米油作对照,未处理组不作处理。诱导当天,配制conA2.5mg/mL,肝炎对照组以及DES治疗组每只小鼠每公斤体重经静脉注射12.5mg conA,未处理对照组以及DES单独组注射登剂量的注射用生理盐水作对照。诱导后1.5小时、6小时、12小时、24小时等时间点抽血分离血清,测血清转氨酶水平以及血清中细胞因子的水平,8小时、24小时终止诱导模型,取出肝脏组织,分离肝脏内浸润的免疫细胞做细胞流式分析；提取肝脏内单核细胞的蛋白进行western blot观察具体分子的表达；取肝脏组织做肝脏组织固定做切片进行组织学分析。结果我们发现在特定浓度的DES处理下,conA诱导的小鼠自身免疫性肝炎,血清转氨酶明显的降低,血清促炎因子(Thl为主)下降,H&E染色显示肝脏浸润细胞减少、坏死灶减少,肝脏细胞凋亡减少；提取肝脏浸润的单核细胞,进行流式细胞学分析发现其中T淋巴细胞降低,单核细胞减少；而免疫抑制性细胞Tregs以及MDSCs则增多。以上说明DES对于conA诱导的自身免疫性肝炎有保护作用。另外对于肝细胞的凋亡,我们选用早期8小时终止诱导。组织固定后切片,进行细胞细胞凋亡实验—Tunnel Assay,结果显示治疗组肝组织细胞的荧光明显较肝炎组弱,说明DES可以抑制自身免疫性肝炎中肝细胞的凋亡,也说明其对于诱导的小鼠肝炎有保护作用。为验证DES对于Treg细胞的影响,我们选择Foxp3-EGFP Knock-in小鼠,分离出其脾脏淋巴细胞,利用细胞分选仪,分选出的Foxp3+-EGFP细胞(Tregs),在96孔板内培养,加入不同剂量的DES,37℃,5%CO2,孵箱内共同培养48小时,最后的8小时加入3H-thymindine2ci/well,共同培养,检测其放射性,结果表明DES在5uM以及20uM时,可以明显增加Tregs的增殖。由此,体外实验同样证实DES可以增加Tregs。结论本实验结果,我们发现雌激素的合成类似物DES可以抑制小鼠自身免疫性肝炎。用它来模拟雌激素在体内对于自身免疫性肝炎的作用,以说明雌激素对于自身免疫性肝炎的保护性作用。同时,由于在女性体内周期性或者不同的年龄阶段雌激素表现为不同的激素水平,这对于研究机体自身免疫性疾病的发病机制也提供可另外一个新的研究方向。本实验中,我们发现DES可以减少自身免疫性肝炎小鼠肝脏浸润的淋巴细胞,减少血清促炎细胞因子(Th1为主),增加抑制性Treg细胞以及MDSCs。说明雌激素可能通过增加体内免疫抑制性细胞Tregs细胞以及MDSCs,抑制Th1细胞因子的分泌,抑制自身免疫性肝炎的发生。证实雌激素可能通过复杂的免疫调节机制,参与到自身免疫性肝炎的发生与发展过程中,其可能会影响该病的预后及转归。这为免疫调节治疗提供了一个新的方向。