背景和目的心脏、肾脏等器官移植术后,患者须长期服用免疫抑制剂类药物预防和治疗排斥反应,以延长移植物存活。吗替麦考酚酯是临床上常用于实体器官移植术后的免疫抑制剂之一,通过肠道吸收后迅速在肝细胞内代谢成其活性成分-霉酚酸。在体内,霉酚酸可以通过非竞争性地、可逆地抑制次黄嘌呤单核苷酸脱氢酶的活性,抑制鸟嘌呤核苷酸的经典合成途径,从而选择性地抑制T淋巴细胞和B淋巴细胞的活化增殖,降低机体的免疫水平,达到减轻对移植物排斥的目的,尽可能保护移植器官功能。但是,吗替麦考酚酯副作用明显,比如白细胞减少、贫血、败血症等,在胃肠道主要为恶心、呕吐、腹痛、腹泻等不良反应,即便使用肠溶剂型也难以改善。临床上多采用减少用药剂量甚至中断服药来减轻副作用。目前,吗替麦考酚酯引发胃肠反应的具体机制尚有待探究。角化细胞生长因子(keratinocyte growth factor,KGF)对多种细胞都具有促进增殖、分化的功能,能够有效改善克罗恩病、缺血再灌注等因素造成的肠粘膜损伤,修复肠粘膜屏障,改善腹痛、腹泻等不良症状。在肠道,KGF多由TCRγδT细胞分泌,在肠粘膜遭受刺激时,KGF表达可升高。多项研究表明,KGF的表达与细胞因子IL-17A高度相关,而作为IL-17A主要细胞来源的Th17细胞,理论上可直接受吗替麦考酚酯的抑制,根据以上反应链条,不难推测:在肠道,吗替麦考酚酯可能通过抑制Th17细胞及其IL-17A的分泌,减少TCRγδT细胞的活化和KGF的表达,进而造成肠粘膜屏障结构和功能受损,这可能是吗替麦考酚酯引发胃肠反应的作用机制之一。为了验证该假说,我们拟建立吗替麦考酚酯诱导的小鼠肠粘膜损伤模型,外源性给予KGF治疗,观察效果并探讨原因;设计体内、外实验,进一步探究吗替麦考酚酯是否通过作用Th17细胞及其特征性细胞因子IL-17A,进而影响肠道TCRγδT细胞表达KGF的部分作用机制。本研究可为减轻吗替麦考酚酯造成的胃肠道反应提供新的研究思路和干预措施。方法:1.建立吗替麦考酚酯诱导小鼠肠粘膜屏障损伤模型C57雄性小鼠,重20 g-25 g,按照:500 mg/kg,每天灌胃1次吗替麦考酚酯混悬液;或:250mg/kg,每天早、晚各灌胃1次的方式建模,连续灌胃14天,每天固定时间称量小鼠的体重,观察小鼠大便性状,处死后称量肠道湿重,并做病理检查,比较两种方法的建模效果。2.外源性KGF对吗替麦考酚酸酯诱导的肠粘损害的保护作用研究我们设计实验,拟从小鼠体重等大体指标、肠道病理变化、肠粘膜通透性、肠上皮细胞凋亡、增殖,紧密链接蛋白表达以及肠粘膜TCRγδ~+IEL细胞比例变化等角度,探究外源性KGF对于MMF模型的肠粘膜保护作用。(1)取30只C57小鼠随机分成3组,每组10只,分别为吗替麦考酚酯组(MMF组),吗替麦考酚酯+重组角化上皮生长因子组(MMF+KGF组)和对照组(Control组);(2)称量各组小鼠体重、观察肛门血污、肠道肉眼下状态并测量其长度;(3)用FITC-Dextran和多功能酶标仪检测小鼠肠粘膜通透性;(4)取小肠做HE染色并用Chiu’s评分法做病理评分,评估各组小鼠肠粘膜损伤情况;(5)免疫荧光法和蛋白印迹法检测肠粘膜细胞紧密链接蛋白表达情况;(6)分别用Brd U法和TUNEL法检测肠粘膜上皮细胞增殖和凋亡情况;(7)流式细胞仪检测对比各组小鼠肠道TCRγδ~+IEL细胞比例。3.吗替麦考酚酯对小鼠肠粘膜Th17细胞比例及IL-17A表达的影响。建立吗替麦考酚酯诱导的肠粘膜损伤模型,并在模型基础上给予Th17细胞回输,或IL-17A细胞因子腹腔注射,观察各组小鼠肠粘膜损伤,Th17细胞比例以及IL-17A表达情况,以期阐释吗替麦考酚酯的肠粘膜损害作用是否与Th17细胞抑制及其IL-17A表达下调有关。(1)动物模型的建立与分组:取40只C57小鼠随机分成4组,每组10只,分别为空白对照组(Control组),吗替麦考酚酯组(MMF组),MMF+Th17细胞回输组(MMF+Th17组),和MMF+IL-17A腹腔注射组(MMF+IL-17A组);(2)取小肠做HE染色并用Chiu’s评分法做病理评分,评估各组小鼠肠粘膜损伤情况;(3)流式细胞仪检测各组小鼠肠粘膜Th17细胞比例;(4)免疫印迹法检测各组小鼠肠粘膜IL-17A的表达;4.IL-17A作用Vγ4细胞表达KGF机制的初步探讨(1)用IL-17A(1μg/kg/day,连续5天)腹腔注射野生型小鼠、抗体清除Vγ1细胞小鼠、抗体清除Vγ4细胞小鼠、JAK/STAT信号阻断剂(AG490)小鼠,空白对照组以同样方式注射生理盐水。5天后,用免疫组化法观察KGF表达情况,蛋白印迹法检测JAK/STAT信号通路蛋白磷酸化情况;(2)体外培养Vγ4T淋巴细胞,实验组用IL-17A刺激,对照组加等量PBS缓冲液,6 h后用ELISA法检测细胞培养上清液中KGF蛋白的表达,用RT-PCR法检测KGF在RNA水平的变化,蛋白印迹法检测Vγ4T细胞内JAK/STAT信号通路蛋白磷酸化情况。结果:1.与以往报道的方法相比,在保证灌饲吗替麦考酚酯总量不变的情况下,早8:00,晚6:00两个时间点分别灌胃的方法具有省时、稳定的优点,所以,我课题组采用这一方法建模。2.与对照组相比,MMF组小鼠体重减轻,肠粘膜损伤和通透性增加,紧密链接蛋白(ZO-1、Claudin-1)的表达减少,分布紊乱。肠粘膜上皮细胞的增殖减少,凋亡增加;相对于MMF组,MMF+KGF组肠粘膜屏障损害减轻,肠上皮细胞增殖增加,凋亡减少;肠上皮细胞间的紧密链接蛋白更加稳定,肠上皮细胞内的TCRγδ~+细胞比例升高。3.与对照组相比,MMF组肠粘膜病理损伤严重,而MMF+Th17组和MMF+IL-17A组肠粘膜损伤好转,病理评分比MMF组下降;流式细胞检测显示MMF组肠粘膜Th17细胞比例下降,MMF+Th17组肠粘膜Th17细胞比例有所回升,MMF+IL-17A组肠粘膜Th17细胞比例与MMF组未见差异。4.免疫组化结果显示,与空白对照组相比,用IL-17A腹腔注射后,模型对照组、抗体清除Vγ1细胞组肠粘膜KGF表达增多,抗体清除Vγ4细胞组、AG490组小鼠KGF表达未见差异;蛋白印迹结果显示,用IL-17A腹腔注射后,与空白对照组相比,模型对照组、抗体清除Vγ1细胞组p-JAK2、p-STAT3表达上升,抗体清除Vγ4细胞组、AG490组小鼠p-JAK2、p-STAT3表达未见差异;在体外细胞培养实验中,相对于对照组,实验组(IL-17A刺激)KGF在蛋白和RNA水平表达升高,蛋白印迹法检测到Vγ4T细胞内p-JAK2、p-STAT3表达升高。5.结论:1.相对于传统,改良后的建模方法(早8:0,晚6:00用250 mg/m L的吗替麦考酚酯混悬液100μL灌胃),建模时间缩短,肠粘膜损伤明确,最终血药浓度与传统方法无差异。模型的稳定性好,成功率高。2.外源性给予KGF可以有效减轻吗替麦考酚酯造成的肠粘膜损伤,这一作用可能是通过促进肠粘膜上皮细胞增殖、抑制其凋亡,保护肠上皮细胞间的紧密链接蛋白(ZO-1、Claudin-1),稳定肠上皮内的TCRγδ~+细胞实现的。3.回输Th17细胞和腹腔注射IL-17A细胞因子可以有效减轻吗替麦考酚酯造成的肠粘膜损伤,这些结果提示:吗替麦考酚酯抑制肠粘膜Th17细胞及IL-17A表达有可能是其造成肠粘膜损伤的部分机制。4.肠粘膜上分泌KGF的γδT细胞亚型主要是Vγ4;IL-17A可以激活Vγ4细胞,增加KGF分泌;体在外实验中,IL-17A可以通过激活JAK/STAT信号通路,上调p-JAK2、p-STAT3水平,进而调控KGF表达;JAK2抑制剂AG490可以有效抑制Vγ4细胞分泌KGF。这些结果提示:IL-17A可通过上调肠粘膜Vγ4细胞JAK/STAT信号通路磷酸化水平调控KGF表达。