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去乙酰化酶抑制剂烟酰胺(NAM)能够显著提高Bacillus nematocida B16的杀线虫能力,因此推测B16杀线虫的过程受蛋白乙酰化的调控。研究相关的调控机制需要对乙酰化酶等相关基因进行敲除,但是在B16中进行基因敲除非常困难,因此本研究具体探索了适用于B16的基因敲除方法。首先,完成乙酰化酶基因acuA和去乙酰化酶基因acuC的序列分析,成功地克隆了这两个蛋白酶的基因。然后,我们筛选了一株抗利福平的B16突变株B16Rif+,利用该突变株,并通过接合转移的办法明显提高了质粒转入B16的效率。在此基础之上,我们通过改造常规载体pCP115,温度敏感型载体pKVM2, CRISPR/Cas9系统载体pCas9,使这三种载体具备接合转移的能力。然后分别利用这三种载体构建了去乙酰化酶基因acuC的敲除载体,通过接合转移的办法转入B16Rif+,挑选转化子,并通过菌落PCR鉴定转化子,结果表明没有鉴定到阳性转化子。本研究发现烟酰胺能够显著提高B16的杀线虫能力,提示我们蛋白乙酰化参与调控B16杀线虫的过程；通过接合转移解决了B16突变株转化效率低的问题；在B16Rif+中探索了多种基因敲除的方法,但是没有获得基因敲除的阳性转化子。本研究为在B16中建立高效的基因敲除方法并最终阐明蛋白乙酰化调控B16杀线虫的分子机制奠定了基础。主要研究结果为：1、NAM提高B16的杀线虫活性在培养B16的培养基中加入去乙酰化酶抑制剂NAM,然后检测其杀线虫活性,发现作用60小时的杀线虫活性由38%提高到了93%,说明烟酰胺能大幅提高B16杀线虫活性,这个结果暗示我们蛋白乙酰化参与调控B16的杀线虫过程。2、通过接合转移提高B16的质粒转化效率通过序列比对,在B16中找到了枯草芽孢杆菌乙酰化酶AcuA的同源蛋白,相似性为85.7%,以及去乙酰化酶AcuC和srtN的同源蛋白,相似性分别为81.4%和77.7%。利用整合型质粒pCP115构建了去乙酰化酶基因敲除载体pCP115-acuC,然后通过化转的方法将上述敲除载体转入野生型B16中。但是,经过多次尝试都没有获得转化子,说明质粒的转化效率非常低。我们通过紫外照射诱变,获得了三株抗利福平抗性的B16菌株B16Rif+。在其中一株抗性菌株中,我们利用接合转移质粒pRK415-kan测试发现,质粒能够通过接合转移转到突变株中,转化效率很高,解决了化转转化效率低的问题。3、改造pCP115为接合转移载体并构建acuC基因的敲除质粒对pCP115进行改造,将质粒pSUP202上控制接合转移的DNA片段mob和卡纳抗性基因kan插入pCP115中,使其成为具有卡纳抗性的接合转移穿梭载体,然后构建去乙酰化酶基因敲除载体pCP115-mob-kan-acuC,用接合转移的方法将其转入B16Rif+中,在卡纳+利福平的双抗板上筛选转化子,并进行菌落PCR验证,结果表明敲除载体没有整合到B16Rif+基因组上,没有筛到阳性转化子。4、利用温度敏感质粒pKVM2尝试敲除acuC基因为了解决pCP115-mob-kan-acuC不整合到基因组上的问题,我们对温度敏感质粒pKVM2进行改造,即插入卡纳抗性基因kan,然后构建去乙酰化酶基因敲除载体pKVM2-kan-acuC,用接合转移的方法将其转入B16Rif+中,在卡纳加利福平的双抗板上筛选转化子,获得的转化子在42-46摄氏度进行温度筛选,但菌落PCR验证结果表明敲除载体没有整合到B16Rif+基因组上,未能敲除acuC基因。5、利用CRISPR/Case9系统尝试敲除敲除acuC基因我们以pCP115-mob-kan作为骨架,把CRISPR/Cas9基因敲除系统中pCas9质粒上包括Cas9、tracrRNA和crRNA在内的5000多bp的片段以及接合转移基因mob和卡纳抗性基因kan插入其中,得到pCP115-mob-kan-Cas9,使其成为具有卡纳抗性的接合转移载体,然后构建去乙酰化酶基因敲除载体pCP115-mob-kan-Cas9-acuC,后续工作就是用其对B16Rif+进行基因敲除,由于时间关系,这部分工作还没有完成。