柑橘精油对单核细胞增生李斯特氏菌的抗菌活性与机理研究

来源 :湖南大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:surezheng12345678
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单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,L.monocytogenes),是一种重要的食源性致病菌,由其引发的李斯特菌病已经对人类健康和安全产生了严重危害。该菌除了能在低温、酸性或者高盐分等环境中生存,又能粘附于食品加工设备表面形成难以清除的生物膜。本研究选取中国的14种主要柑橘栽培品种,提取其精油(Essential oil,EO)并分析组成成分,通过比较不同品种精油间的抗菌活性,筛选出具有较强抗菌活性的柑橘精油品种,并通过统计学方法分析了精油成分与抗菌能力之间的关系。通过显微观察、转录组学和蛋白质组学等手段对胡柚精油、佛手精油和芳樟醇对单核细胞增生李斯特氏菌的抗菌活性和机理进行了深入研究,主要研究结果如下:(1)14种中国主要栽培品种的柑橘精油化学成分和抗菌能力的评估与比较分析。结果表明,在14种精油中共鉴定出200多种成分,主要由萜烯、醇、醛、酯、酮和酸等组成。测定了14种精油和7种主要成分对6种细菌和2种真菌的抗菌能力,结果表明,革兰氏阳性菌对精油的敏感性比革兰氏阴性菌高,真菌对精油的敏感性高于细菌。根据抗菌能力将14种精油分为三组(强、中和弱),并通过统计学方法将化学成分与不同精油的抗菌活性进行关联分析。胡柚精油和佛手精油对所有测试菌株均表现出很强的抗菌活性,芳樟醇对除铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)以外的所有参试菌株均表现出很强的抗菌活性。(2)胡柚精油对单核细胞增生李斯特氏菌具有良好的抗菌活性。第一,胡柚精油对浮游态的单核细胞增生李斯特氏菌表现出显著的抗菌能力,扫描电镜(scanning electron microscopy,SEM)和透射电镜(transmission electron microscopy,TEM)观察均证实精油处理后菌体出现不同程度的物理损伤、形态学变化和细胞内容物泄漏。第二,胡柚精油能够通过降低生物量和细胞活性破坏成熟生物膜。扫描电镜、激光共聚焦显微镜(confocal scanning laser microscopy,CLSM)和COMSTAT分析表明精油处理后生物膜受到破坏并产生明显的结构改变。第三,通过转录组学分析了胡柚精油潜在的分子抗菌机制。通过对精油处理组和对照组差异表达基因的分析,共发现2804个差异表达基因,其中1709个基因表达下调,1095个基因表达上调。GO富集分析表明上述差异表达基因与8个细胞成分类群(包括细胞内部分、细胞质部分和细胞组分等)、50个生物过程类群(包括三羧酸循环、碳固定和有机羟基化合物运输等)和21个分子功能类群(包括有机羟基化合物跨膜转运蛋白活性、硫化合物跨膜转运蛋白活性和无机阴离子跨膜转运蛋白活性等)密切相关。(3)佛手精油对单核细胞增生李斯特氏菌具有良好的抗菌活性。第一,佛手精油对浮游态的单核细胞增生李斯特氏菌具有较强的抗菌能力,扫描和透射电镜均可观测到明显的形态变化。第二,佛手精油在抑制生物膜形成和消除成熟生物膜上均表现出良好的抗生物膜活性,生物膜中的代谢活性细胞显著增加,生物膜结构完整性受到破坏,生物膜的生物量、厚度和基质覆盖率显著降低。第三,通过转录组学分析,共挖掘到1553个差异表达基因,其中794个基因表达下调,759个基因表达上调。GO分析表明上述差异表达基因参与了一系列细胞反应,包括代谢过程、细胞过程、单一生物过程、细胞部分、膜、催化活性、结合和转运蛋白活性等。KEGG通路分析表明,佛手精油处理后,单核细胞增生李斯特氏菌的反应和适应方式如下:(1)通过提高鞭毛旋转来增加运动能力;(2)促进细胞翻滚并重新定向以逃避佛手精油;(3)提高对环境中碳水化合物的吸收,以获取更多能量;(4)改变对铁、锌、钴和镍等金属阳离子的吸收能力。(4)芳樟醇对单核细胞增生李斯特氏菌具有良好的抗菌活性。第一,芳樟醇对浮游态的单核细胞增生李斯特氏菌具有较强的抗菌能力,通过扫描和透射电镜的显微观测,将芳樟醇处理后引起的菌体形态变化划分为7个阶段,并观察到间体的存在和发展过程。第二,芳樟醇对单核细胞增生李斯特氏菌的成熟生物膜具有较强的清除能力,可通过离散和杀死生物膜中细菌的方式破坏生物膜。第三,过通转录组学分析,共发现2824个差异表达基因,其中1897个基因表达下调,927个基因表达上调。GO富集分析表明,上述差异表达基因主要参与了以下功能类群:细胞成分类群(包括细胞内、细胞质和细胞组分等)、生物过程类群(包括代谢过程、单生物过程和单生物运输等)和分子功能类群(包括有阳离子结合、金属离子结合和催化活性等)。第四,通过比较蛋白质组学分析了芳樟醇潜在的抗菌机制,共筛选出445个差异表达蛋白,其中表达上调211个,表达下调234个。GO富集分析筛选出31个显著性富集的功能类群,其中12个为细胞成分类群(包括生物粘附、生物调控和碳利用等)、10个为生物过程类群(包括细胞、细胞部分和胞外区域等)、9个为分子功能类群(包括抗氧化功能、结合和催化活性等)。通过KEGG富集分析,共得到60个显著性富集的生物学通路。其中“细胞过程”大类6个,“细胞过程”大类6个,“环境信息处理”大类6个,“人类疾病”大类3个,“代谢”大类40个,“有机系统”大类2个。
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