论文部分内容阅读
目的：2010年糖尿病患者人数达到2.85亿,将近全世界成人数量的7%,糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病患者常见的慢性微血管并发症,也是终末期肾衰竭的最主要原因。DN的发生是多种原因综合作用的结果,近年来研究揭示DN的发病除了与代谢紊乱和血流动力学改变的影响有关外,炎症机制是其持续发展的关键因素之一,其中炎性细胞因子转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β,TGF-β1)、纤维粘连蛋白(Fibronectin,FN)起重要作用。雷公藤多苷是我国传统中草药,具有免疫抑制作用,目前已经广泛应用于多种自身免疫性疾病的治疗。其是否可以减少尿蛋白,改善肾脏损害,需要进一步研究证实。此外,观察DN时肾脏组织TGF-β1和FN的表达情况,有助于我们对DN发病机制的理解,还有重要的治疗意义。本研究主要通过建立2型DN模型大鼠,应用雷公藤多苷(Tripterygium wilfordii polyglucoside,TWP)对该模型进行干预性治疗,观察实验动物的24小时尿蛋白、血常规、肝功能、肾功能,光镜、电镜观察肾脏病理形态学以及RT-PCR、免疫组织化学法分析肾组织中TGF-β1及FN等的变化,探讨雷公藤多苷对DN大鼠肾脏预防治疗作用的可能机制。方法：清洁级雄性SD大鼠136只,随机选取16只分为预防正常对照组(PNC组)、治疗正常对照组(TNC组),每组8只,饲以常规饲料；其余120只大鼠以高糖高脂饲料喂养4周联合小剂量STZ(30mg/kg)尾静脉注射建立T2DM模型,将成模大鼠随机分为预防模型对照组(PDM组)、预防雷公藤多苷低剂量组(PTL组,6mg/kg)、预防雷公藤多苷中剂量组(PTM组,12mg/kg)、预防雷公藤多苷高剂量组(PTH组,24mg/kg)及治疗模型对照组(TDM组)、治疗雷公藤多苷低剂量组(TTL组,6mg/kg)、治疗雷公藤多苷中剂量组(TTM组,12mg/kg)、治疗雷公藤多苷高剂量组(TTH组,24mg/kg),每组15只。雷公藤多苷预防组于成模后即开始灌胃,灌胃4周后处死；雷公藤多苷治疗组于成模后第5周开始灌胃,第8周末处死；PNC、TNC组和PDM、TDM组以等量蒸馏水灌胃。实验过程中记录大鼠体重(BW)、血糖、24小时尿微量白蛋白(UMA)变化,STZ注射前内眦取血测血脂。实验结束时：①留取血标本用于血常规、肝肾功能、血脂测定；记录BW、肾脏重量(KW)；②留取肾组织标本,光镜、电镜观察肾脏病理及超微结构的变化；RT-PCR法检测TGF-β1和FN的表达；免疫组化法检测TGF-β1和FN的表达,明确TGF-β1和FN在DN中的作用以及雷公藤多苷治疗的影响和可能机制。结果(1)成功制备DN模型,24h尿蛋白特点及肾脏病理变化符合人类2型糖尿病肾病的特点及病理变化。(2)预防及治疗组模型大鼠血糖均维持在16.7mmol/L以上；肾重／体重的比重均较正常对照组增加(P<0.05)；雷公藤多苷给药后各组肾重／体重的比重较模型组均有所降低,其中雷公藤多苷给药中剂量组下降最明显。(3)预防组成模第4周末时,各组的UMA水平均比正常对照明显升高,雷公藤多苷给药后各组UMA均有所下降,其中给药中剂量组UMA水平下降最明显(P<0.05)；治疗组成模第4周末及第8周末时,各组的UMA水平均较成模时明显升高(P<0.05),成模第8周末时,模型对照组及雷公藤多苷给药各组的UMA水平均比正常对照组明显升高(P<0.05),雷公藤多苷给药后各组UMA均有所下降(P<0.05),其中PTM组UMA水平下降最明显(P<0.05)。(4)肝肾功、血脂结果显示：预防PTH组AST水平较其余各组明显升高(P<0.05)；预防组各组间ALT、SCr及BUN水平比较无统计学差异(P>0.05)；治疗组各组间AST、ALT、SCr及BUN水平比较也无统计学差异(P>0.05)。高脂饲料饲养4周后,模型组大鼠TG、TC水平与正常组大鼠比较明显升高(P<0.05),预防组和治疗组大鼠分别与正常对照组比较,模型对照组、雷公藤多苷给药各组TG、TC均明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。血常规结果显示：雷公藤多苷治疗给药组淋巴细胞较TNC组明显降低(P<0.05),雷公藤多苷预防组中淋巴细胞无明显差异(P>0.05),其余白细胞、红细胞、血小板、血红蛋白、单核细胞和中性粒细胞在各组间均无明显差异(P>0.05)；(5)光镜、电镜结果显示：预防组和治疗组中正常对照组大鼠肾小球体积、肾小球系膜区、肾小囊,肾小管及肾间质均未见明显异常。预防组和治疗组的模型对照组均可肾小球和肾小管DN的肾脏病理改变。雷公藤多苷给药后各组上述病理性改变均有所改善,其中雷公藤多苷给药中剂量组均改善最明显。(6)实时荧光定量PCR显示,与正常对照组相比较,所有DM组TGF-β1、FNmRNA表达水平均显著升高,具有统计学意义(P<0.05)；雷公藤多苷干预和治疗组的TGF-β1、FN mRNA表达水平与模型对照组比较均显著下降,具有统计学意义(P<0.05)；其中,中剂量组表达量下降最显著,与其余各组比较均具有统计学差异。(7)免疫组化结果显示,TGF-β1、FN在DM各组的肾小球及肾小管中均有表达,且主要表达于肾小管区域。雷公藤多苷干预和治疗组的TGF-β1、FNmRNA表达水平与模型对照组比较均显著下降,具有统计学意义(P<0.05)；其中,中剂量组表达量下降最显著。结论(1)成功制备DN模型,24h尿蛋白特点及肾脏病理变化符合人类2型糖尿病肾病的特点及病理变化。(2)雷公藤多苷给药后,预防组和治疗组UMA均有所下降,尤其是雷公藤多苷中剂量给药组UMA水平下降最明显,雷公藤多苷具有降低尿蛋白的作用,可有效延缓DN的发生发展。(3)糖尿病大鼠肾脏组织炎性相关因子TGF-β1、FN的表达水平明显上调,提示肾组织局部的炎症反应和纤维化作用,导致肾小管间质及肾小球损伤,参与了DN的发生与发展。(4)雷公藤多苷给药后,预防组和治疗组TGF-β1、FN表达量均分别较模型对照组显著下降,尤其是中剂量组TGF-β1、FN表达量下降明显,推测雷公藤多苷可能具有抑制炎性细胞因子的表达,减少肾组织局部的炎症反应和纤维化作用,从而延缓DN的发生发展。