目的动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)和经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention, PCI)术后再狭窄(restenosis, RS)等增生性血管疾病是目前威胁人类健康最严重的疾病之一,研究其防治策略具有重要意义。近年研究发现,成熟血管壁的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMC)具有极大可塑性。生理状态下血管壁中VSMC处于分化表型,血管损伤后,VSMC可发生表型逆转,由分化表型(收缩表型)转变为去分化表型(合成表型),并获得增殖、迁移及合成、分泌大量细胞外基质的能力。VSMC由分化表型向去分化表型的转化是AS及PCI术后RS等疾病发生中新生内膜形成和管腔狭窄的重要病理基础。因此,对VSMC表型转化机制的研究是增生性血管病防治研究的一个重要方向。1998年,Gill等研究提示,人E1A激活基因阻遏子基因(cellular repressor of E1A-stimulated genes, CREG)可以诱导细胞的分化和成熟,并参与成熟组织中细胞分化状态的维持。我室自1999年应用mRNA差异显示技术首次从体外培养的人胸廓内动脉血管平滑肌细胞(Human internal thoracic artery smooth muscle cell,,HITASY)中克隆出了人CREG基因,并证实CREG表达与VSMC分化呈高度相关,提示CREG参与了体外培养的VSMC由增殖表型向分化表型转化。但是CREG作为分泌型蛋白质,其诱导VSMC分化和抑制VSMC增生的机制尚待阐明。Gill实验室通过Far Western分析提示[1],CREG可与细胞膜上的甘露糖6磷酸/胰岛素样生长因子II受体(mannose-6-phosphate/insulin-like growth factorⅡreceptor,M6P/IGF2R)发生相互作用,在人畸胎瘤细胞中发挥抑制增殖和/或促进分化的作用,并证实CREG与M6P/IGF2R的相互作用是通过CREG蛋白的糖基化位点介导的。为明确M6P/IGF2R在CREG调控VSMC分化中的作用,本室进行了相关的预实验研究,发现用蛋白磷酸酶PP2A的特异性抑制剂岗田酸(okadaic acid)处理VSMC后,细胞膜表面M6P/IGF2R减少,从而使外源性CREG蛋白诱导的VSMC分化受到抑制,提示膜受体蛋白M6P/IGF2R可能参与了CREG对VSMC分化的调控。本研究将着重阐明M6P/IGF2R是否介导了CREG蛋白的生物学功能,CREG与M6P/IGF2R之间是否发生直接相互作用、相互作用的结合位点及其与CREG蛋白分子中糖基化结构的关系。方法(1)用RT-PCR技术扩增终止密码突变的人CREG开放读码框,构建含有myc和His标签的野生型CREG(wtCREG)真核表达载体pcDNA3.1 myc-His/wtCREG,以及3个糖基化位点(第160, 193和216位的Asn残基)全部突变为Ala残基的去糖基化突变型CREG(mCREG)真核表达载体pcDNA3.1 myc-His/mCREG。Lipofectamine 2000转染人293F细胞株,用G418筛选出稳定表达的细胞克隆,大量扩增后提取细胞蛋白,用Ni-NTA亲合层析方法纯化,并进行糖苷酶切和Western blot检测鉴定,得到野生型和糖基缺失突变的CREG蛋白(wtCREG和mCREG),并通过与标准品白蛋白对比,计算出纯化蛋白的浓度;(2)将纯化得到的重组wtCREG及mCREG蛋白以不同浓度,加入本室保存的人胸廓内动脉VSMC系(简称为HITASY细胞)和HITASY细胞衍生的、经逆转录病毒介导的、shCREG干扰后CREG蛋白低表达的人VSMC(简称为OB2细胞)培养液中,应用流式细胞分析方法检测细胞增殖情况,比较两种CREG蛋白对细胞增殖效应的调控作用,确定两种蛋白调控人VSMC生物学行为的最适浓度。将最适浓度的两种蛋白质分子分别加入HITASY和OB2细胞培养上清液中,应用细胞流式分析、Western blot、细胞刮伤实验、明胶酶电泳分析等方法观察两种重组人CREG蛋白对人VSMC增殖、迁移、分化等生物学行为的影响;通过不同浓度(2,4,8μg/μL)的M6P/IGF2R抗体阻断实验、免疫荧光双染色和免疫共沉淀等检测方法,分析CREG蛋白是否与M6P/IGF2R存在直接结合,进一步明确M6P/IGF2R介导两种CREG蛋白质生物学功能;(3)进一步应用RT-PCR合成M6P/IGF2R细胞外不同结构域(M6P/IGF2R-1:1~3结构域;M6P/IGF2R-2:4~6结构域;M6P/IGF2R-3:7~10结构域)cDNA片段,并构建带有His标签的PQE31- M6P/IGF2R-1,2,3载体,在大肠杆菌JM109菌株中表达,通过Ni-NTA亲合层析纯化得到人M6P/IGF2R胞外结构域蛋白小肽。进一步应用SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定纯化蛋白的准确性,并通过与标准品白蛋白对比,计算出纯化蛋白的浓度。应用固相吸附实验,检测固化的M6P/IGF2R(R&D Systems)胞外结构域(其中11~15号结构域—IGF2R-4—从R&D公司购买)与纯化的wt/mCREG的直接结合,并通过Scatchard分析计算离解常数(KD值)。分别应用M6P和6-磷酸葡糖糖(glucose 6-phosphate,G6P)进行体外竞争性结合实验,进一步确定CREG蛋白与M6P/IGF2R相互作用是否与蛋白的糖基化有关。将与wt/mCREG蛋白高亲合的M6P/IGF2R胞外重组小肽片段分别添加到细胞培养上清中,确定wt/mCREG蛋白对VSMC生物学行为的调控作用(流式细胞分析检测细胞增殖、刮伤实验和明胶酶谱分析细胞迁移能力)是否通过其与M6P/IGF2R小肽的直接亲合作用介导。结果( 1 )制备并纯化得到重组的人wtCREG/myc-His和mCREG/myc-His标签蛋白:1)RT-PCR扩增出终止密码突变的人CREG cDNA片段,插入PMD-18T载体中,经酶切及测序证实插入片段序列正确;用BamH I/EcoR I双酶切将CREG cDNA片段亚克隆至pcDNA3.1 myc-His真核表达载体中,构建完成pcDNA3.1 myc-His/wtCREG重组质粒,测序确定插入序列正确;将生工公司合成的氨基酸突变的CREG cDNA片段经BamH I/EcoR I酶亚克隆至pcDNA3.1 myc-His真核表达载体中,构建完成pcDNA3.1 myc-His/mCREG重组质粒,测序确定插入序列正确;2)将构建完成的pcDNA3.1 myc-His/wt/mCREG重组质粒转染至人293F工程细胞株中,通过G418抗性筛选获得高表达CREG蛋白的抗性克隆。大量扩增克隆细胞株,收集细胞后进行裂解提取细胞中蛋白质,经Ni-NTA亲合层析纯化获得重组人wtCREG/myc-His和人mCREG/myc-His标签蛋白。经糖苷酶切和Western blot检测证实分别为含有糖基结构的CREG和去糖基突变型的CREG蛋白;SDS-PAGE电泳确定重组蛋白质的分子量,与标准品白蛋白对比,计算出纯化的重组蛋白浓度分别为0.893μg/μL和0.972μg/μL,纯度为92%和93%;(2)两种重组CREG蛋白生物学效应检测及其细胞膜表面受体机制:1)最适宜效应浓度分析:将两种纯化的重组CREG蛋白稀释成不同浓度(200、400、800、1600nM),加入经去血清培养72h进行同步化的HITASY和OB2细胞培养上清中,8h后收集细胞用流式细胞仪分析细胞周期,结果显示:各组细胞G0/G1期细胞比例均有所增加,添加wtCREG蛋白组作用更加明显,而且两种CREG蛋白发挥生物学功能的最佳浓度均为400nM。上述实验结果证实:两种重组CREG蛋白对VSMC增殖均有剂量依赖性的抑制作用,并且相同浓度的糖基化的CREG蛋白对细胞增殖的抑制效应更为显著,最佳效应浓度为400nM;2)两种重组CREG蛋白添加后对HITASY和OB2细胞生物学行为的影响:①CREG蛋白对VSMC迁移的影响:刮伤实验发现,加入最佳效应浓度的wtCREG和mCREG蛋白24h后,OB2组迁移能力下降,HITASY组无明显变化;细胞外基质金属蛋白酶-2,9(Matrix metallo-proteinase 2,9,MMP2 ,9)明胶酶电泳检测和Western blot检测结果证实,两种CREG蛋白均可以使OB2细胞合成细胞外基质MMP2,9减少,而组织金属蛋白酶抑制物(Tissue Inhibitors of Metalloproteinases,TIMPs)增加;②CREG蛋白对VSMC分化的影响:加入400nM的wtCREG和mCREG蛋白12h后,OB2细胞myocardin、SMα-actin、MHC、caldesmin表达增加,LM-1、FN表达减少;③流式细胞仪分析细胞周期和BrDU染色分析证实,加入400nM的wtCREG和mCREG蛋白后,OB2组G0/G1期细胞由0.5308分别增加至0.5773和0.5572,HITASY组G0/G1期细胞由0.6297分别增加至0.7369和0.7034;3)M6P/IGF2R在重组CREG蛋白的生物学功能中的调控作用:①免疫共沉淀和免疫荧光双染色分析结果显示,CREG蛋白与M6P/IGF2R存在直接结合;②应用抗体阻断实验:将不同浓度的anti- M6P/IGF2R(2、4、8μg /mL)与两种CREG蛋白同时加入培养液中,CREG蛋白抑制VSMC增值、迁移和合成细胞外基质、促进分化的效应减弱,而且与加入anti- M6P/IGF2R浓度正相关。上述实验结果证实:两种重组CREG蛋白对体外培养的HITASY和OB2细胞向分化表型转化有明显的促进作用,同时抑制细胞的增殖、迁移和合成细胞外基质的能力,并且两种重组CREG蛋白对VSMC生物学行为的调控均可被M6P/IGF2R中和抗体阻断,CREG蛋白与M6P/IGF2R存在直接结合;(3)与两种重组CREG蛋白相互作用的M6P/IGF2R结构域分析:1)RT-PCR扩增含有不同结构域M6P/IGF2R cDNA片段,插入PMD18-T载体中,测序确定插入片段序列准确。用Sph I/Sal I双酶切将M6P/IGF2R cDNA片段亚克隆至PQE31-His原核表达载体中,构建完成重组质粒,测序确定插入序列正确;载体质粒感染大肠杆菌JM109菌株后扩增,并通过Ni-NTA亲合层析纯化获得原核表达蛋白,SDS-PAGE分析确定重组蛋白的分子量分别为:54kD(IGF2R-1),44kD(IGF2R-2),62kD(IGF2R-3)。Western blot分析证实所获得的M6P/IGF2R-1,2,3重组蛋白均为M6P/IGF2R和His标签重组蛋白,并将三种重组蛋白的浓度均调整为10nM。ELISA分析结果证实:重组wtCREG蛋白与IGF2R-3和IGF2R-4具有高结合力,KD值分别为0.1063pM和0.2106pM;重组的mCREG蛋白与M6P/IGF2R IGF2R-4存在高亲和力, KD值为6.488pM;其中wtCREG与M6P/IGF2R-3/ IGF2R-4结合作用可以被M6P竞争抑制;2)将不同浓度的M6P/IGF2R的第11~15结构域和第7~10结构域小肽片段与两种重组CREG蛋白共同加入体外培养的OB2细胞中,观察重组CREG蛋白对OB2增殖和迁移的效应变化,结果发现:wtCREG和mCREG对细胞生物学行为的调控作用均被M6P/IGF2R的第11~15结构域小肽阻断,而第7~10结构域小肽片段仅对wtCREG蛋白的生物学效应有明显的阻断作用,对mCREG的生物学作用无效。结论CREG可以作为分泌型蛋白,通过细胞膜表面M6P/IGF2R蛋白抑制VSMC的增殖、迁移、分泌细胞外基质,并促进其由未分化表型向分化表型转化,其作用与其分子中糖基化结构无关,糖基化可以增强CREG的生物学功能,wtCREG蛋白在M6P/IGF2R作用位点主要是7~10号和11~15号结构域,而mCREG蛋白在M6P/IGF2R作用位点主要是11~15号结构域。