目的宫颈癌是女性最常见的生殖道恶性肿瘤，其病死率居女性癌症病死率的第二位，是严重威胁妇女健康的主要疾病之一。研究证实，高危型人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）是导致宫颈癌的主要原因。几乎所有的宫颈癌组织含有HPV，其中，HPV-16、HPV-18是最常见的型别。HPV18高表达的宫颈癌具有浸润性强、从宫颈非典型增生到浸润癌进展快、淋巴转移率高、复发率高等特点，而目前临床采用的治疗方法，如手术、放疗和化疗等方法创伤大，副反应重，而且可能剥夺年轻患者的生育功能。随着宫颈癌发病的年轻化和患者对治疗后生活质量要求的提高，寻求一种新的微创、副反应小、可以根治肿瘤的方法势在必行。Hela细胞为人宫颈腺癌细胞株，细胞内有HPV18基因组。研究证实，高危型HPV18基因组中E6、E7基因是恶性转化基因，具有细胞转化功能，其编码的E6、E7蛋白同时表达是恶性转化、恶性表型维持的关键。高危型HPV E6、E7与细胞周期调节因子P53、视网膜母细胞瘤蛋白（Retinoblastoma protein，pRB）相互作用，直接干预细胞周期进程，在HPV诱导肿瘤形成过程中发挥至关重要的作用。因而HPV E6、E7成为HPV阳性宫颈癌基因治疗的理想靶标。RNAi作为一种新的用于基因功能和基因治疗研究的工具，具有特异性高、稳定性好，抑制作用强、细胞摄取容易等优点，已被广泛用于病毒的基因功能及病毒相关疾病的基因治疗研究，并取得了令人欣喜的效果。但有关RNAi抑制HPV18及细胞内HPV18恶性转化基因E6抑制后细胞周期调控因子变化的研究较少。本研究以HPV18 E6为靶标，利用RNAi技术进行以下研究：①针对高度保守的、具有恶性转化作用的HPV18 E6基因设计同源小干扰RNA（small interference RNA，siRNA）序列，化学合成后，转入含HPV18基因组的宫颈癌细胞Hela细胞株中，通过抑制细胞内HPV E6、E7基因的表达，改变Hela细胞的肿瘤特性，阻断细胞永生化。②针对HPV18 E6基因的外显子和内含子区域构建shRNA表达载体，建立稳定转染细胞株，研究此细胞株中HPV E6、E7基因的表达水平，初步探讨HPV阳性宫颈癌基因治疗的可行性。③通过抑制HPV E6、E7基因，研究细胞内P53的变化，为深入认识宫颈癌的发病机制提供理论依据。方法1、HPV18 E6基因特异性同源序列siRNA的设计根据siRNA的设计原则，从HPV18 E65’端AUG翻译起始密码子下游寻找符合设计特征的靶序列。序列经BLAST进行同源性分析。2、化学合成siRNA转染Hela细胞用不含血清和抗生素的培养液稀释siNeoFX，室温孵育10 min，与稀释的siRNA混合后室温孵育10 min，加入细胞，37℃培养箱中培养。3、细胞转染效率观察FAM-siRNA转染Hela细胞24h后，倒置荧光显微镜下计数10个200倍视野有荧光的细胞数，计算荧光细胞占总细胞的百分率，即转染效率。4、HPV-siRNA对Hela细胞HPV E6、E7 mRNA及HPV E6、E7、P53及HPA蛋白的影响提取细胞总RNA，RT-PCR检测细胞内HPV18 E6、E7 mRNA的变化。Western Blot检测细胞内HPV18 E6、E7、P53及乙酰肝素酶（heparanase，HPA）蛋白表达的变化。扩增条带与蛋白质条带用计算机采图，并用分析软件进行灰度分析。5、相差显微镜观察转染48h后细胞形态变化。6、MTT检测细胞增殖率细胞转染48h后，以每孔750个细胞接种于96孔细胞培养板中，培养5天后，每孔加20μl的MTT溶液，37℃、5％CO₂，饱和湿度下孵育4h，吸出孔内培养液，每孔加二甲基亚砜（DMSO）150μl，酶标仪检测每孔吸光度值（A）。按下述公式计算细胞增殖率：细胞增殖率=（实验组平均A值/对照组平均A值）×100％。7、双层软琼脂克隆形成实验检测细胞克隆形成能力取含0.5％琼脂的营养液1ml加入12孔细胞培养板中，室温凝固为底层琼脂。用含0.3％琼脂的营养液稀释转染48h后的细胞，以每孔300个细胞均匀涂在底层琼脂的表面，加含10％新生牛血清的培养液1ml。静止培养2周后，镜下观察并计数大于50个细胞的克隆数。通过每孔平均克隆数计算克隆形成率。克隆形成率（％）=平均克隆数/每孔加入的细胞数×100％。克隆形成抑制率（％）=（1-实验组克隆数/对照组克隆数）×100％。8、流式细胞仪检测细胞周期分布细胞转染后48小时，常规胰酶消化，PBS洗细胞，70％冷乙醇4℃过夜固定，PBS洗1次，加1ml含RNA酶（RNase）的碘化丙啶，4℃染色30min，离心弃染色液，PBS重新悬浮细胞，尼龙网过滤，流式细胞仪分析。9、表达载体的构建及鉴定人工合成针对靶序列HPV18 E6基因的两条寡核苷酸链，寡核苷酸链两端加入酶切位点，便于和表达载体连接。取正反向寡核苷酸链，与退火缓冲液混匀，94℃水浴3min，退火自然冷却至室温。质粒37℃酶切1h，酶切产物电泳，凝胶回收试剂盒回收大片段。退火片段与线性化表达载体连接，将连接产物按常规方法转化感受态大肠杆菌DH5α，经含卡那霉素的平板筛选阳性克隆，采用酶切和DNA序列分析进行鉴定。10、pHPV对Hela细胞HPV18 E6、E7的表达及P53影响采用阳离子聚合物转染pHPV进入Hela细胞，G418筛选转染pHPV的细胞，建立稳定转染细胞株，提取细胞内总RNA，RT-PCR方法检测HPV18 E6、E7 mRNA，Western Blot检测HPV18 E6、E7、P53及HPA蛋白表达的变化，采用灰度分析软件对扩增条带与蛋白质条带进行灰度分析。结果1、HPV18 E6基因特异性同源序列siRNA的设计靶序列为基因组外显子区434-452，内含子区287-305，BLAST进行同源性分析后证实该区域与人类基因组没有明显的同源性。2、细胞转染效率观察结果转染FAM-siRNA的Hela细胞镜下可见绿色荧光，转染效率约为85％。3、HPV-siRNA对细胞HPV E6、E7 mRNA及HPV E6、E7、P53、HPA蛋白的影响HPV E6扩增片段大小为196bp、HPV E7扩增片段大小为332bp，细胞转染后48h，siRNA实验组HPV E6、E7 mRNA含量分别为阴性对照组的33.33％、36.78％。细胞转染后120h，siRNA实验组HPV E6、E7 mRNA含量分别为阴性对照组的90.91％、101.60％。siRNA实验组HPV E6、E7、P53及HPA蛋白含量分别为阴性对照组的37.98％、33.84％、2.194倍及41.78％。4、HPV-siRNA对Hela细胞形态的影响siRNA作用后的Hela细胞出现形状变圆，体积变小，细胞内颗粒增多，胞浆内出现空泡，培养液可见悬浮细胞等改变。5、HPV-siRNA对Hela细胞增殖及细胞克隆形成能力的影响siRNA减慢细胞增殖速度，降低细胞软琼脂克隆形成能力。siRNA实验组细胞增殖率为阴性对照组的31.40％，克隆形成抑制率为阴性对照组的65.25％。6、HPV-siRNA对Hela细胞周期的影响siRNA实验组G₀/G₁期细胞比率为77.47％，S期细胞比率为19.92％，而阴性对照组G₀/G₁期细胞比率为60.39％，S期细胞比率为35.83％。7、表达载体的构建及鉴定结果成功构建HPV shRNA表达载体pHPV1、pHPV2，酶切和DNA测序证实了表达载体构建成功。8、pHPV对Hela细胞HPV18 E6、E7及P53表达的影响pHPV1实验组细胞内HPV18 E6、E7 mRNA含量分别为阴性对照组的30.75％、37.58％，E6、E7及P53蛋白分别为阴性对照组的36.75％、31.34％及2.991倍；pHPV2实验组细胞内HPV18 E6、E7 mRNA含量分别为阴性对照组的54％、77.3％，E6、E7及P53蛋白分别为阴性对照组的51.81％、83.22％及1.878倍。结论1、化学合成HPV-siRNA能明显抑制Hela细胞HPV18 E6、E7的表达，减少细胞内HPA蛋白的水平，诱导细胞周期调控因子P53累积。2、化学合成HPV-siRNA能抑制Hela细胞体外生长增殖能力，并诱导细胞周期重新分布。3、构建的pHPV1、pHPV2表达载体能抑制Hela细胞HPV18 E6、E7的表达，诱导细胞周期调控因子P53累积，针对外显子区434-452的pHPV1抑制作用更强。4、HPV18基因组434-452和基因组287-305是RNAi有效的作用靶点。