论文部分内容阅读
研究目的:研究低剂量甲基叔丁基醚（MTBE）诱导机体DNA损伤的适应性反应及其量效关系,为正确评价MTBE的遗传毒性提供新的依据;同时探讨多聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶-1（PARP-1）在适应性反应形成机制中的作用。研究方法:1.采用MTT实验观察MTBE对体外培养的中国仓鼠肺细胞（CHL细胞）的细胞毒性,确定IC50及其最大无作用剂量（NOAEL）,同时观察MTBE作用于CHL细胞能否产生毒物兴奋效应,并据此确定预染毒剂量。2.采用单细胞凝胶电泳（SCGE）实验研究低剂量MTBE诱导CHL细胞DNA损伤的适应性反应以及PARP阻断剂3-氨基甲苯酰胺（3-AB）对适应性反应的影响。3.运用流式细胞术研究低剂量MTBE诱导CHL细胞凋亡的适应性反应以及3-AB能否阻断适应性反应的发生。4.运用Western blotting技术检测不同剂量的MTBE作用CHL细胞6h后PARP-1蛋白表达量的改变。5.通过呼吸道静式染毒,用不同低剂量MTBE染毒雌性昆明小鼠30天,每天2h,第31天用大剂量染毒2h,然后用SCGE技术检测MTBE能否诱导小鼠外周血白细胞及肝细胞DNA损伤的适应性反应。研究结果:1.MTT实验结果显示,MTBE对CHL细胞的IC50为32.1g/L（95%CI为27.6～38.7g/L）,NOAEL为20.0g/L,未观察到毒物兴奋效应。2.单细胞凝胶电泳实验结果显示,低于20.0g/L的MTBE直接作用于CHL细胞18小时后并未对CHL细胞DNA造成损伤;当剂量高于30.0g/L时则可导致细胞DNA的明显损伤,表现为绝大部分细胞出现拖尾情况,其SCGE实验主要距离指标、强度指标和矩类指标与正常对照组比较,差异有统计学意义（P＜0.05）。而0.5～2.5g/L的MTBE预处理CHL细胞6h后,可明显减轻随后50.0g/L冲击剂量的MTBE染毒造成的DNA的损伤,其SCGE实验主要距离指标、强度指标和矩类指标与正常对照组比较,差异无统计学意义（P＞0.05）,表现出明显的适应性反应。在低剂量MTBE处理细胞6h后,用3-AB抑制PARP-1的活性并不能阻断适应性反应的产生;而在低剂量预处理细胞前即用3-AB抑制PARP-1的活性,则可以阻断适应性反应的产生。3.对细胞凋亡率及细胞周期的观察结果显示,剂量为1.0g/L的MTBE作用于CHL18h后,并未对细胞的凋亡率及周期相产生影响;剂量高于35.0g/L时,凋亡率明显升高,细胞周期改变明显,细胞发生明显的G2期阻滞。以0.5～10.0g/L的MTBE预处理CHL细胞6h后,可降低随后35.0g/L的MTBE导致的细胞凋亡的增加,并使G2期阻滞减轻（其中2.5g/L预处理组最明显）,细胞产生了适应性反应。用3-AB抑制PARP-1活性后,各预处理组细胞凋亡率均有所减少,且各预处理组间差异无统计学意义（P＞0.05）:细胞周期与未加3-AB时基本一致,表明3-AB明显改变了CHL细胞的凋亡率,但并未对细胞周期产生明显影响。4.不同剂量的MTBE作用于CHL细胞6h后,通过Western blotting实验观察到,分子量为116KD的PARP-1蛋白条带在各剂量组并无明显差别,但40.0g/L、10.0g/L处理组分子量为86KD的蛋白条带（PARP-1蛋白降解后的片段之一）明显比其他剂量组浓,表明这两个剂量组PARP-1蛋白降解比其他剂量组高。5.雌性昆明小鼠经静式呼吸道染毒后,SCGE实验检测小鼠外周血白细胞、肝细胞DNA损伤情况,结果显示,直接暴露于10 000 mg/m3的MTBE 2h后对小鼠外周血白细胞和肝细胞的DNA产生了明显损伤,SCGE实验主要评价指标与正常对照组比,差异均有统计学意义（P＜0.05）;而预先暴露于126～1260mg/m3的MTBE 1个月后,可不同程度的减轻随后高剂量的MTBE（10 000 mg/m3）对小鼠外周血白细胞、肝细胞DNA的损伤,表现出不同程度的适应性反应,其中1260mg/m3预剂量组最明显,其SCGE实验主要评价指标与正常组比差异无统计学意义（P＞0.05）,小鼠在此剂量产生了明显的适应性反应。结论:1.0.5～2.5 g/L的MTBE可明显诱导CHL细胞对大剂量MTBE染毒所致DNA损伤的适应性反应,且在此剂量范围内未见其对CHL细胞DNA有所损伤;126～1260mg/m3的气态MTBE可不同程度诱导雌性昆明小鼠外周血白细胞和肝细胞对大剂量染毒所致DNA损伤的适应性反应。据此我们认为MTBE虽在高剂量时具有遗传损伤性,但长期低剂量接触却并不一定有害;其致癌性及其他遗传毒性效应可能并不是MTBE对人体健康的主要危害,它对环境的污染才是其主要危害。2.PARP-1在低剂量MTBE诱导的CHL细胞DNA损伤的适应性反应形成过程中具有关键作用。发生明显适应性反应的剂量并不对CHL细胞DNA造成损伤。适应性反应的发生可能是由于低剂量MTBE作用于CHL细胞后,MTBE作为外源化学物刺激CHL细胞通过磷酸化的ERK2激活途径激活了PARP-1,从而增强了细胞的免疫功能以及DNA损伤修复能力。3.本研究的受试生物体为体外培养的CHL细胞和昆明小鼠,由于受到种属特性的限制,以上结论尚不能外推于人,因此有必要进一步对人的体细胞进行研究。