ES细胞及其体外分化模型能够模拟胚胎正常发育进程,在发育生物学、转基因动物的生产、克隆动物、动物和人类疾病模型的建立、药物的开发和筛选、基因治疗、细胞组织和器官的修复和移植治疗等方面都有广泛的应用前景。目前常用于胚胎干细胞鉴别及质量控制的表面标记主要有糖脂类SSEA-1、SSEA-3、 SSEA-4以及蛋白多糖类TRA-1-60、TRA-1-81、GCTM2等,这些表面标记最初是通过畸胎瘤或胚胎免疫获得单克隆抗体后筛选得到的。OCT4、NANOG等转录因子的标志物抗体则直接使用蛋白作为免疫原免疫动物所获得的。然而这些标志物的特异性有一定的局限性：它们在一些成体于细胞、正常组织或癌细胞中也有一定表达,胚胎干细胞特异性的膜表面标志数量更是有限。因此发现新的ES细胞功能性分子及特异性标志物至关重要。本研究利用小鼠单克隆抗体技术筛选蛋白质组学提示的候选标志物分子,从100余个未经功能注释的hES新膜表面蛋白挑选30个,表达重组蛋白,免疫BALB/c小鼠,通过WB筛选阳性克隆,获得一组针对重组蛋白阳性的小鼠单克隆抗体组。再通过hES的ICC染色鉴定,获得9个hES染色阳性的抗体。通过ICC免疫荧光染色和IHC组织芯片的检测方法,发现GRAMD1A蛋白特异性表达于多种上皮细胞,可以作为一种新的广泛性上皮细胞标志物,在再生医学和肿瘤诊断上是非常有价值的。接着,我们利用小鼠单克隆抗体反向筛选mES标志物。将小鼠胚胎干细胞(全细胞)免疫BALB/c、鼠,通过ICC筛选,获得大量针对小鼠胚胎干细胞染色阳性的杂交瘤。其中6个单克隆抗体针对mESC染色较为特异,并通过流式分析进一步确定了这6个抗体对应的抗原随着mESC的自发分化都有显著下降。然后采用免疫共沉淀的方法纯化抗原,通过质谱检测鉴定到其中一个蛋白是核仁磷酸蛋白(nucleophosmin, NPM)。最近有研究发现,NPM/B23对于胚胎发育和维持基因组稳定性是必需的,NPM1基因失活可导致无限制的中心体复制和基因组失稳。本研究的实验结果显示,NPM1广泛分布于成体组织,且在大部分的肿瘤细胞上高表达,随着ES的自发分化表达量下降,与已有的文献结果相符合。抗体B3-C1针对的抗原特异性表达于未分化的mES,免疫组织化学染色结果显示其主要表达于睾丸的初级精母细胞和子宫的子宫内膜细胞,很可能是一种新的干细胞特异性标志物。虽然目前还无法鉴定其对应的蛋白,但是这个抗体作为干细胞鉴定的一种工具还是非常有意义的。Zinc finger and SCAN domain-containing 4 (Zscan4)基因最初被鉴定是在小鼠着床前胚胎的二细胞期特异性表达。Zscan4在小鼠ES细胞里的表达是瞬时、可逆的。其特有的表达模式表现为,只有1-5%的ES细胞在同一时间表达该基因。在小鼠胚胎干细胞中敲除基因Zscan4后,小鼠胚胎干细胞的ALT过程被抑制,细胞端粒长度在六代内下降了30%。同时,胚胎干细胞的核型正常率由88%下降到65%,细胞分裂逐渐停滞,凋亡细胞的比例显著上升。Zscan4基因对于长期维护mES细胞潜能起着积极作用。根据这个提示,我们通过制备针对人的高特异性Zscan4小鼠单克隆抗体,检测了Zscan4在人胚胎干细胞和成体组织上的分布规律,探索其在hES上的功能。虽然人的Zscan4和小鼠Zscan4基因在序列上有较大差异,但是实验结果显示,Zscan4在维护hES全能性上也同样起了积极的作用。组织芯片结果表明,Zscan4集中表达于人组织的血管内皮细胞,且在不同肿瘤细胞上出现不同程度的阳性表达,暗示Zscan4与肿瘤发生的正相关关系。