恶性肿瘤是以细胞异常增生为特征的常见疾病，早期诊断和及时治疗是降低肿瘤患者死亡率的关键。但恶性肿瘤的早期诊断和有效控制仍是医学界的棘手问题。手术治疗、放射治疗与药物治疗仍是目前治疗恶性肿瘤的常规手段。但这些传统的治疗手段常难以获得理想效果，医学界仍在不断探索治疗肿瘤的新方法。光动力学疗法（Photodynamic therapy，PDT）是逐渐趋向成熟的治疗肿瘤和非肿瘤疾病的一种新手段。光动力学疗法因具有目标专一、效果显著、对正常组织伤害小等优点，在临床实践中取得了令人瞩目的成就。　　 激光免疫疗法（Laser immunotherapy，LIT）是在光动力学疗法的基础上发展的一种将特定波长的激光、光敏剂（光吸收剂）和免疫佐剂相结合的肿瘤综合治疗新方法。激光免疫疗法既利用了激光光热、光化学的局部破坏作用，又激发了宿主的免疫防御系统。作为一种新型肿瘤治疗方法，远期疗效好，在恶性肿瘤治疗上展现出很好的应用前景。但其抗肿瘤免疫机制尚未明确，免疫效率也有待提高。基于揭示机理提高疗效的目的，本课题运用现代荧光成像技术，从细胞和在体两方面去揭示激光免疫疗法引起的细胞杀伤及机体免疫机制，并探讨其内在联系。并在机理研究的基础上探讨、发展更为有效的肿瘤治疗方法。激光免疫疗法的抗肿瘤免疫机制的研究，将有利于填补激光免疫疗法的基础理论，并进一步推动激光免疫疗法的开发及应用。　　 本研究以检测活细胞和在体内激光免疫疗法引起的细胞死亡及机体免疫过程为中心，运用现代荧光成像等技术，从细胞和在体水平揭示激光免疫疗法引起的细胞凋亡以及机体免疫调控机制。分别从光动力疗法对肿瘤的杀伤机制和免疫效应机制着手，探讨激光免疫疗法中最为重要的两个因素-杀伤效应和免疫效应的作用机制，深入探讨二者之间的联系，寻找最佳的杀伤效应与免疫效应的结合。　　 同时，本研究基于杀伤机制与免疫调控机制的研究，逐步发展探索新的治疗方法，寻求能将杀伤效应和免疫效应有效结合、显著提高肿瘤治疗效果、减少机体损伤的肿瘤治疗方法，推动激光免疫疗法在肿瘤治疗中的应用。主要结果如下：　　 1，深入探讨光动力治疗过程中杀伤效应和免疫机制之间的联系。本研究应用荧光成像等技术，实时检测PDT诱导的凋亡/坏死细胞与巨噬细胞的相互作用过程。结果显示：PDT诱导的凋亡细胞能够被巨噬细胞识别吞噬，并能够活化巨噬细胞。进一步研究发现，在凋亡早期，胞质内的部分热休克蛋白70（Heat shock protein，HSP70）迅速转位到细胞表面，并在整个凋亡过程中稳定存在于细胞表面。通过多克隆抗体阻断凋亡细胞表面HSP70的作用，则显著降低巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬及巨噬细胞的活化。阻断巨噬细胞表面HSP70受体同样有效抑制凋亡细胞诱导的巨噬细胞活化。以上研究结果证明，PDT诱导的凋亡和坏死细胞均能活化巨噬细胞，且HSP70以不同方式参与活化调控。在坏死细胞诱导的巨噬细胞活化过程中，携带抗原的HSP70释放出坏死细胞，被巨噬细胞识别，吞噬，引起巨噬细胞的活化。在凋亡细胞诱导的巨噬细胞活化过程中，凋亡细胞内部分HSP70转位细胞表面，被巨噬细胞表面的HSP70受体识别，进而介导巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬，获得抗原；并通过激活受体介导的信号通路进而活化巨噬细胞。本研究首次发现PDT诱导的凋亡细胞能够刺激巨噬细胞活化，并首次探讨凋亡细胞和坏死细胞不同的免疫刺激调控过程，有助于深入了解PDT诱导的免疫调控机制，为PDT临床应用及激光免疫疗法的发展提供新的实验依据。　　 2，开发单壁碳纳米管（Single-walled carbon nanotubes，SWNTs）介导的线粒体靶向杀伤的肿瘤激光热疗法。为了避免PDT治疗过程中光敏剂的光毒性，并充分利用HSP70的免疫调节作用，我们寻找一种优化的激光治疗方法--碳纳米管介导的光热疗法。碳纳米管是一种新颖的纳米材料，在近红外区域对激光能量具有强烈吸收效应，并将光能量迅速转化为热能，产生的热效应导致了细胞的立刻崩溃。本研究中采用的CoMoCAT SWNTs具有结构均一（直径0.81 nm）、在近红外980 nm处有特征吸收峰等特点。结果显示：SWNTs与细胞共孵育能够进入细胞，在激光照射下，能迅速将光能转化为热能，有效杀伤细胞。进一步研究SWNTs在细胞内的定位发现，SWNTs能够选择性定位于线粒体，而不进入溶酶体、内质网、高尔基体等细胞器。深入探讨SWNTs定位机理发现，阻断细胞膜的吞噬能力并不影响SWNTs进入细胞，但破坏线粒体的膜电位则会影响SWNTs在线粒体的定位，因此SWNTs能够选择性定位于线粒体与线粒体膜电位相关。在激光照射下，定位于线粒体的SWNTs能够将光能转化为热能，通过破坏线粒体诱导细胞凋亡。进一步在体研究显示，Laser+SWNTs治疗组的肿瘤生长抑制效果、小鼠瘤体脱落数及小鼠存活数均明显高于Laser治疗组，碳纳米管的应用显著增强了激光热疗的效果。本研究首次发现SWNTs能够作为一种靶向线粒体的光热转换探针，并首次将其应用于肿瘤光热治疗。　　 3，开发新的激光免疫疗法将杀伤效应与免疫效应有效结合。我们将免疫佐剂修饰的碳纳米管应用于光热治疗，建立一种新的光热免疫疗法。利用SWNTs的光热转换特性及药物运载特性，能有效的将免疫佐剂运送至肿瘤部位，并在激光照射下杀伤肿瘤细胞。利用免疫佐剂的大分子特征，既能结合SWNTs增强其生物活性，又能保持免疫佐剂特性。本研究采用SWNT-GC复合物为光吸收材料和免疫增强剂，以波长980 nm激光作为光源，治疗小鼠乳腺癌等模型。结果显示：SWNT-GC能够进入肿瘤细胞，在激光照射下，SWNT-GC通过协同作用将热杀伤效应和免疫增强效应有机结合起来。SWNT吸收光能产生热能杀伤细胞，定位在肿瘤部位内的GC结合凋亡过程中产生的内源抗原（HSP70），联合增强免疫应答。Laser+SWNT-GC治疗组不仅能够有效杀伤肿瘤，而且能够引发长期的抗肿瘤免疫效应，控制肿瘤复发。本研究采用免疫修饰的碳纳米管开拓了一种新的激光免疫治疗方法，不仅避免了传统应用光敏剂所引起的机体光敏毒性，而且应用近红外980 nm激光有效增加治疗深度，利用特异性光热转换吸收剂增强杀伤效应。并且首次提出光吸收剂和免疫佐剂同体系应用、协同作用的方法，增强杀伤和免疫刺激作用。　　 综上所述，本课题通过阐明光动力学疗法过程中的杀伤机制和免疫调控机制，以及两者之间的内在联系，明确激光免疫疗法的抗肿瘤免疫机制，并进一步开发新的激光免疫疗法，使得杀伤效果与免疫效果有效结合，有助于推动激光免疫疗法这一新型肿瘤治疗方法的发展。