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研究背景:心肌肥厚是多种心血管疾病(Cardiovascular disease,CVD)的共同病理生理性表现;在疾病早期,心肌肥厚具有代偿意义,但持续发展会导致心衰、猝死等严重后果。研究表明,蛋白质巯基亚硝基化修饰,即蛋白质半胱氨酸上的自由巯基(-SH)在一氧化氮(Nitric oxide,NO)作用下生成亚硝基硫醇(-SNO),可参与调控多种心血管疾病。腺苷酸转移酶1(Adenine Nucleotide Translocator 1,ANT1)是线粒体内膜上参与ADP/ATP转运的跨膜蛋白,对线粒体功能具有重要调节作用。线粒体自噬(Mitophagy)是指细胞通过自噬机制选择性清除多余或损伤线粒体的过程。程序性坏死(Necroptosis)是近年来发现的一种由受体相互作用蛋白激酶3(Receptor interacting protein kinase-3,RIP3)介导的程序性细胞死亡模式。ANT1的巯基亚硝基化修饰(ANT1-SNO)是否参与心肌肥厚,调节心肌肥厚的机制是否与线粒体自噬和程序性坏死相关目前尚不清楚。研究目的:明确ANT1-SNO在心肌肥厚中的调节作用,在体内和体外深入探究ANT1-SNO调节心肌肥厚的具体机制,为临床心肌肥厚的治疗提供新的干预靶点。实验方法和结果:动物实验:(1)将C57BL/6小鼠尾静脉注射aav-9腺相关病毒使心肌细胞特异性过表达野生型(WT)或半胱氨酸160位点(Cys160)突变的ANT1(aav-9-ANT1WT/C160A小鼠),行TAC手术造心肌肥厚模型,多普勒超声检测左室心肌肥厚指标及心功能。结果显示:与假手术组(Sham)相比,aav-9-ANT1 WT小鼠TAC术后,室间隔厚度(Interventricular Septum,IVS)和左室后壁厚度(Left Ventricular Posterior Wall,LVPW)明显增加,而突变ANT1的Cys160位点后左室肥厚程度减轻,心功能正常。(2)运用生物素转换法富集巯基亚硝基化蛋白,免疫印迹分析检测心肌组织中ANT1-SNO水平。结果显示:与Sham组相比,aav-9-ANT1 WT小鼠TAC术后ANT1-SNO水平明显增高,而突变ANT1的Cys160位点后ANT1-SNO被显著抑制。(3)提取心肌组织总蛋白,检测自噬标志蛋白LC3 II/I的表达。结果显示:与Sham组相比,aav-9-ANT1 WT小鼠TAC术后心肌的LC3 II/I蛋白表达水平显著降低,而突变ANT1的Cys160位点可有效抑制LC3 II/I的降低。(4)将心肌组织的冰冻切片行DHE荧光染色,检测心肌组织活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平。结果显示:与Sham组相比,aav-9-ANT1 WT小鼠TAC术后ROS水平明显增加,但ANT1的Cys160位点突变可显著降低TAC引起的ROS增加。(5)运用免疫共沉淀结合免疫印迹分析技术检测心肌组织中程序性坏死信号分子RIP1-RIP3复合物表达水平。结果显示:与Sham组相比,aav-9-ANT1 WT小鼠TAC术后RIP1-RIP3复合物的水平显著升高,而ANT1的Cys160位点突变可在一定程度上抑制TAC引起的RIP1-RIP3的激活。细胞实验:(1)将SD乳大鼠(1-3天)心室肌细胞(Neonatal rat ventricular myocytes,NRVM)转染腺病毒过表达野生型(WT)或Cys160位点突变的ANT1(Ad-ANT1WT/C160A),Ang II刺激48小时,运用免疫印迹和免疫荧光技术检测线粒体自噬水平。结果显示:Ang II刺激后NRVM的LC3 II/I表达水平显著降低,线粒体自噬水平(LC3与线粒体探针Mito-tracker共定位)也显著下降;突变ANT1的Cys160位点可显著改善Ang II引起的线粒体自噬降低。(2)运用免疫共沉淀结合免疫印迹分析技术检测程序性坏死信号分子RIP1-RIP3复合物表达水平。结果显示:突变ANT1的Cys160位点可显著抑制Ang II引起的RIP1-RIP3复合物水平升高。(3)为明确程序性坏死是否参与调节ANT1-SNO介导的心肌肥厚,在NRVM上转染Ad-ANT1 WT/C160A,给予RIP1抑制剂Necrostain-1(Nec-1),Ang II刺激48小时,检测肥厚相关基因脑利钠肽(Brain natriuretic peptide,BNP)、心房利钠肽(Atrial natriuretic peptide,ANP)和β肌球蛋白重链(beta-myosin heavy chain,β-MHC)的m RNA表达水平,检测心肌细胞肥大程度。结果显示:抑制程序性坏死的激活可显著改善ANT1-SNO介导的心肌细胞肥大。结论:以上研究结果表明ANT1的Cys160位点发生巯基亚硝基化修饰,降低线粒体自噬,促进程序性坏死信号通路的激活,促进了心肌肥厚的发生。