论文部分内容阅读
目的:探究酪酸梭菌双歧杆菌二联活菌对早产小鼠外周血、脾脏和小肠派氏淋巴结不同时间点T细胞表面BTLA及其HVEM表达和淋巴细胞亚群分化的影响,为益生菌制剂在临床中调节早产儿免疫失衡提供基础依据。方法:采用米非司酮(RU486)腹腔注射方法建立无菌早产动物模型。孕鼠妊娠第18天给予腹腔注射米非司酮(剂量0.15mg/kg,提前溶于蓖麻油中),连用两天,收集妊娠<20天内的早产存活幼鼠,随机分为早产实验组(n=40)和早产对照组(n=40),不进行干预的足月产小鼠作为足月对照组(n=40)。早产实验组给予酪酸梭菌双歧杆菌二联活菌灌胃(商品名:常乐康,酪酸梭菌活菌数1.0*10~7CFU/m L,双歧杆菌1.0*10~6 CFU/m L,灌胃体积为100ul/10g),早产对照组与足月对照组同一时间段给予等量生理盐水灌胃,三组小鼠经上述处理后返回母鼠身边喂养。三组新生鼠分别在生后第1天(Postnatal day 1,P1)、P7、P14、P21,各组随机选取10只幼鼠经乙醚麻醉后,采用眼球取血法取外周血至少500ul,EDTA-K2抗凝,置于冰上备用。无菌取脾脏和小肠派氏淋巴结(Peryer pathes,PP)(PP仅选择生后P14、P21小鼠),随机切取1/3脾脏和PP,病理HE染色观察淋巴细胞活化情况;另2/3采用机械研磨法制备细胞悬液。脾脏和小肠PP细胞悬液与外周血均采用红细胞裂解术制备淋巴细胞悬液,后采用流式细胞术检测T细胞表面BTLA及HVEM表达量,以及B、T和NK细胞百分率。结果:1.在P1、P7、P14和P21,早产对照组小鼠体重均低于足月对照组(P<0.05);P1和P7早产实验组小鼠体重低于足月对照组(P<0.05),P14和P21两组比较无差别(P>0.05);P1早产实验组与早产对照组无差别(P>0.05),P7、P14和P21均高于早产对照组(P<0.05)。2.P1、P7、P14和P21早产对照组小鼠脾脏重量均低于足月对照组(P<0.05);P1和P7早产实验组低于足月对照组(P<0.05),P14和P21两组之间比较无差别(P>0.05);P21早产实验组重于早产对照组(P<0.05)。在P1、P7、P14和P21幼鼠脾脏指数在三组间比较均无差异(P>0.05)。P1、P7、P14和P21三组新生小鼠小肠PP和脾脏生理结构逐渐完整,淋巴细胞活化比例逐渐增多。3.在P1新生小鼠脾脏和外周血中CD4~+T、CD8~+T和NK细胞水平,足月对照组均高于早产对照组和早产实验组(P<0.001),早产实验组和早产对照组之间无差别(P>0.05);CD4~+/CD8~+和B细胞水平在三组间比较无差别(P>0.05)。4.在P7脾脏和外周血,P14和P21小肠PP,P21脾脏CD4~+T细胞水平,早产实验组高于早产对照组(P<0.05)。在P7脾脏,P14和P21小肠PP、脾脏和外周血CD4~+T细胞水平,早产实验组低于足月对照组(P<0.05)。在P7早产实验组外周血CD4~+T细胞水平高于足月对照组(P<0.05)。在P7脾脏和外周血,P14和P21小肠PP、脾脏,P14外周血CD8~+T细胞水平,早产实验组高于早产对照组(P<0.05)。在P7和P14脾脏,P14和P21小肠PP、外周血CD8~+T细胞水平,早产实验组低于足月对照组(P<0.05);但在P7外周血和P21脾脏CD8~+T细胞水平,早产实验组高于足月对照组(P<0.05)。在P7、P14脾脏,P14小肠PP和外周血CD4~+/CD8~+比率,早产对照组高于足月对照组和早产实验组(P<0.05)。P14外周血CD4~+/CD8~+比率,足月对照组高于早产实验组(P<0.05),但P14脾脏足月对照组低于早产实验组(P<0.05)。P21小肠PP、外周血CD4~+/CD8~+三组间无差别(P>0.05)。5.在P7外周血、P21脾脏CD4~+T细胞BTLA水平早产实验组低于足月对照组和早产对照组(P<0.05);在P7和P14脾脏,P14小肠PP和外周血、P21外周血中早产实验组高于足月对照组和早产对照组(P<0.05);在P21小肠PP中早产实验组高于早产对照组(P<0.05)。在P7、P14和P21脾脏、P14和P21外周血、P21小肠PP中CD4~+T细胞HVEM水平,早产实验组高于早产对照组(P<0.05),但均低于足月对照组(P<0.05)。P7外周血和P14小肠PP中CD4~+T细胞HVEM水平,早产实验组高于足月对照组和早产对照组(P<0.05)。在P7、P14和P21外周血,P7和P14脾脏中CD8~+T细胞BTLA水平,早产实验组高于早产对照组(P<0.05),但低于足月对照组(P<0.05);P14小肠PP早产实验组高于足月对照组和早产对照组(P<0.05)。在P21小肠PP和脾脏中,早产实验组低于足月对照组和早产对照组(P<0.05)。在P7、P14和P21脾脏和外周血中CD8~+T细胞HVEM水平,早产实验组高于足月对照组和早产对照组(P<0.05)。在P14和P21小肠PP中CD8~+T细胞HVEM水平,早产实验组高于早产对照组(P<0.05),但低于足月对照组(P<0.05)。6.在生后小肠PP、脾脏和外周血中B和NK细胞水平逐渐升高;早产实验组B细胞水平均高于足月对照组和早产对照组(P<0.05);在P7脾脏中,早产实验组NK细胞水平低于足月对照组(P<0.05);在P14、P21小肠PP和外周血中,早产实验组高于足月对照组和早产对照组(P<0.05);在P7外周血,P14、P21脾脏中,三组间NK细胞水平无差别(P<0.05)。结论:1.早产小鼠存在相应固有免疫和适应性免疫能力低下,酪酸梭菌双歧杆菌二联活菌可能通过促进早产小鼠外周免疫器官和免疫细胞的发育成熟,以改善早产小鼠免疫功能。2.酪酸梭菌双歧杆菌二联活菌可能通过介导CD4~+T和CD8~+T细胞表面BTLA/HVEM表达的下降/上升,防止T细胞过度活化或无能的发生,从而有效调节早产小鼠T细胞免疫平衡。3.酪酸梭菌双歧杆菌二联活菌可能通过促进早产小鼠B细胞及NK细胞的发育成熟,以改善适应性免疫与固有免疫,其效果和应用酪酸梭菌双歧杆菌二联活菌干预的时间长短相关。