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研究背景及意义:唾液酸（Sialic Acid,SA）又称为神经氨酸,是一类广泛存在于生物系统中的天然糖类衍生物。人体中超过50%以上的蛋白质为糖蛋白,这些糖蛋白的糖链末端常常被唾液酸修饰,它们在人体生长发育、疾病的发生发展以及病原微生物的感染过程中发挥重要的作用。现已证明,流感病毒以细胞表面唾液酸为受体,病毒颗粒与受体的结合是病毒感染的先决条件,因此,利用唾液酸化糖蛋白中和病毒颗粒表面的受体结合位点,从而阻断病毒颗粒对宿主细胞的黏附是一种有效的预防流感的策略。虽然已经证明牛奶中含有丰富的唾液酸化糖蛋白,但目前能够用于富集具有完整结构的唾液酸化糖蛋白的方法较为繁杂、费时费力,得率也不高。此外,研究表明随着人体衰老,皮肤成纤维细胞的活性降低,导致皮肤衰老或产生衰老相关的疾病,而且皮肤成纤维细胞表面的唾液酸修饰水平随人体的衰老而降低,但目前皮肤成纤维细胞表面唾液酸修饰水平与其细胞功能之间的联系仍未完全阐明。因此,本研究首先制备了五羟色胺-磁性微粒复合物,并利用该复合物富集牛奶中的唾液酸化糖蛋白,然后对牛奶唾液酸化蛋白及其N-糖链进行鉴定和表征,最后,研究了牛奶唾液酸糖蛋白抗流感病毒及抗皮肤衰老和促进皮肤伤口愈合的潜能。本研究将为唾液酸化糖蛋白抗流感病毒及促进皮肤伤口愈合的规模化应用提供理论和技术依据。方法:1.以环氧化修饰的四氧化三铁磁性微粒为载体,通过其环氧基团与五羟色胺的氨基反应,将五羟色胺固定到磁性微粒的表面,制备成五羟色胺-磁性微粒复合物,并利用该复合物富集牛奶中的唾液酸化糖蛋白,最后,通过唾液酸定量与凝集素印迹实验验证富集的效率及特异性;2.利用LC-MS/MS和MALDI-TOF/TOF-MS技术对牛奶唾液酸化糖蛋白及其N-糖链结构进行鉴定和表征。然后,分别以马鞍树凝集素-Ⅱ（Maackia Aimrensis Lectin-Ⅱ,MAL-Ⅱ）和黑接骨木凝集素（Sambucus nigra agglutinin,SNA）作为禽流感病毒和人流感病毒的模拟物验证牛奶唾液酸化糖蛋白抗流感病毒的能力;3.利用高碘酸钠对牛乳铁蛋白上的唾液酸进行氧化,然后比较天然牛乳铁蛋白和去唾液酸化牛乳铁蛋白对禽流感和人流感病毒模拟物（MAL-Ⅱ和SNA）结合MDCK细胞的抑制作用,阐明乳铁蛋白上唾液酸化糖链抗流感病毒的能力;4.研究牛奶唾液酸化糖蛋白对正常人真皮成纤维细胞（Normal human dermal fibroblast,NHDF）增殖、迁移、胶原合成以及唾液酸修饰的影响,证明其抗皮肤衰老及促进皮肤伤口愈合的潜能。结果:1.与环氧化修饰的四氧化三铁磁性微粒相比,五羟色胺-磁性微粒复合物的红外吸收光谱在1342.39cm-1波数处具有特征性的C-N键的吸收峰;2.五羟色胺-磁性微粒复合物富集到的牛奶唾液酸化糖蛋白的唾液酸含量约为原始牛奶蛋白的3倍,牛奶唾液酸化糖蛋白在SDS-PAGE中主要分布在80,33、30和22k Da处,其中80k Da的蛋白质主要含有α2-6连键的唾液酸结构,33和30k Da的蛋白质主要含有α2-3连键的唾液酸结构;3.在牛奶唾液酸化糖蛋白中共鉴定到了91种蛋白质和24种N-糖链,其中88种蛋白质（96.7%）已被注释或预测为糖蛋白,12种N-糖链含有α2-6连键的唾液酸结构,5种N-糖链含有α2-3连键的唾液酸结构;4.5μg/m L的牛奶唾液酸化糖蛋白显著抑制MAL-Ⅱ或SNA与MDCK细胞的结合,并且在100μg/m L浓度范围内,随着蛋白浓度的增大其抑制作用增强;当破坏牛奶唾液酸化糖蛋白上的唾液酸结构后,其对MAL-Ⅱ或SNA与MDCK细胞结合的抑制作用消失;5.20μg/m L的牛乳铁蛋白能够显著抑制MAL-Ⅱ和SNA与MDCK细胞的结合（抑制效率分别为40%和85%）,但牛乳铁蛋白经10m M高碘酸钠氧化后（其唾液酸含量由0.462%下降为0.037%）,该抑制作用降低（抑制效率分别为30%和60%）;6.0.5mg/m L的牛奶唾液酸化糖蛋白能够显著促进NHDF细胞的增殖、缩短细胞倍增时间（37.9±2.7 h vs 31.1±1.0 h,p＜0.05）,而且还能够促进NHDF细胞的迁移和体外创伤模型（含成纤维细胞的胶原网格,Fibroblast-populated collagen lattice,FPCL）的收缩;7.0.5mg/m L的牛奶唾液酸化糖蛋白显著抑制NHDF细胞对转化生长因子-β1（Transforming growth factor-β1,TGF-β1）和Ⅰ型胶原蛋白（TypeⅠcollagen,COL-Ⅰ）的分泌,但促进对成纤维细胞生长因子（Basic fibroblast growth factor,FGF-2）的分泌;8.0.5mg/m L的牛奶唾液酸化糖蛋白显著上调NHDF细胞中β-半乳糖苷α2-6唾液酸转移酶1（ST6β-galactosideα-2,6-sialyltransferase-1,ST6GAL1）的表达,增加NHDF细胞表面α2-6唾液酸修饰水平,但对α2-3唾液酸修饰水平没有显著性影响。结论:1.五羟色胺通过其氨基成功固定到环氧基修饰的四氧化三铁磁性微粒表面,制备成五羟色胺-磁性微粒复合物,该复合物能够有效地富集牛奶中的唾液酸化糖蛋白;2.牛奶唾液酸化糖蛋白能够抑制禽流感和人流感病毒颗粒对宿主细胞的黏附,并且其α2-3/6唾液酸结构发挥主要的抗黏附作用;3.牛乳铁蛋白上含有α2-3/6连键的唾液酸结构,但以α2-6连键的唾液酸结构为主;10m M的高碘酸钠能够有效破坏牛乳铁蛋白上唾液酸的结构,但不影响乳铁蛋白的结构;牛乳铁蛋白上α2-6连键的唾液酸结构能够有效抑制人流感病毒颗粒对宿主细胞的黏附;4.牛奶唾液酸化糖蛋白能够促进NHDF细胞的增殖和迁移,加速FPCL的收缩,并且抑制COL-Ⅰ的分泌,表明牛奶唾液酸化糖蛋白具有促进皮肤伤口愈合并抑制瘢痕形成的潜能;此外,牛奶唾液酸化糖蛋白还能够上调NHDF细胞中ST6GAL1的表达,增加NHDF细胞表面α2-6唾液酸修饰水平,提示牛奶唾液酸化糖蛋白可能抑制或延缓人体衰老过程中皮肤成纤维细胞表面α2-6唾液酸修饰水平的降低,具有抗皮肤衰老的潜能。