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泌乳性状是重要的经济性状,乳腺是影响奶山羊泌乳性状的重要泌乳器官,乳腺的发育和泌乳是乳腺上皮细胞不断增殖、分化与凋亡等生理事件。近年来研究表明,非编码RNA广泛参与乳腺发育及泌乳等生理活动,其中包括:miRNA靶向调控m RNA的3’非翻译区;circRNA“海绵”吸附miRNA等。基于实验室前期测序结果发现miR-574-5p在奶山羊泌乳高峰期和泌乳前期差异表达,而miR-574-5p对奶山羊乳腺上皮细胞具体的分子调控机理尚不清楚。本试验以关中奶山羊乳腺上皮细胞为研究对象,根据实验室前期测序和软件预测交叉所得到的miR-574-5p靶基因及circRNA数据库选定本试验研究的m RNA及circRNA。本试验通过建立奶山羊乳腺上皮细胞的体外培养体系,运用双荧光素酶报告系统检测miR-574-5p与EVI5L、miR-574-5p与circRNA-006258之间的靶向关系;通过RT-q PCR、Western blot、CCK-8、Ed U、细胞凋亡等检测circRNA-006258/miR-574-5p/EVI5L对奶山羊乳腺上皮细胞增殖和乳合成的调控作用。本试验的主要研究结果如下:1.EVI5L是miR-574-5p的靶基因分别构建EVI5L野生型和突变型双荧光素酶报告载体,检测双荧光素酶相对活性可知,EVI5L的野生型载体显著下调双荧光素酶活性,而突变型载体无明显变化,由此得出结论,EVI5L是miR-574-5p的靶基因;通过RT-q PCR和WB试验可知,miR-574-5p mimic可以降低EVI5L在m RNA和蛋白水平的表达,而miR-574-5p inhibitor使EVI5L在m RNA和蛋白水平的表达都显著升高。由此得出结论,EVI5L是miR-574-5p的靶基因并受到miR-574-5p的抑制。2.circRNA-006258通过吸附miR-574-5p解除其对EVI5L的抑制作用将所构circRNA-006258的野生型和突变型CHECK2载体与miR-574-5p mimics、inhibitor、NC及inhibitor NC分别共转至GMECs,双荧光素酶活性检测结果显示,野生型载体的双荧光酶活性显著降低,突变型载体则无显著性变化;通过合成si-circRNA-006258,将si-circRNA-006258和NC分别转染至GMECs中,通过RT-q PCR、WB试验检测EVI5L m RNA和蛋白水平表达情况,发现si-circRNA-006258组中EVI5L的m RNA和蛋白水平都显著低于NC组。由此得出结论circRNA-006258通过海绵吸附miR-574-5p解除其对EVI5L的抑制作用。3.circRNA-006258/miR-574-5p/EVI5L调节乳腺上皮细胞增殖及乳合成信号通路构建EVI5L的过表达载体,分别合成EVI5L和circRNA-006258的干扰RNA,分别转染至GMECs,通过WB试验,探索circRNA-006258/miR-574-5p/EVI5L轴调节乳腺上皮细胞增殖及乳合成的信号通路。试验结果显示,circRNA-006258/miR-574-5p/EVI5L可以通过Rab23/ITGB1/TIAM1/Rac1-TGF-β/Smad通路调节GMECs的细胞周期,促进其S期;提高Bcl2的蛋白表达量,减少Bax的蛋白表达,从而调控GMECs的细胞增殖;激活PI3K/AKT-m TOR信号通路促进GMECs中甘油三酯和β-酪蛋白的生成。综上所述,本试验初步验证了circRNA-006258作为miR-574-5p的分子海绵对其有吸附作用,从而解除miR-574-5p对EVI5L的抑制作用,从circRNA、miRNA和m RNA三个方面,并构建circRNA-006258/miR-574-5p/EVI5L轴,全面地阐述影响奶山羊乳腺上皮细胞增殖及乳合成的分子机理,为奶山羊泌乳以及精准育种提供科学依据。