大熊猫繁殖能力极低,种群数量较少,虽然近年来大熊猫人工繁育技术已取得显著成果,但总体还存在大熊猫屡配不孕等繁殖问题。阴道定植着数量巨大、不同种属的微生物,其对机体健康具有重要的作用。细菌性或真菌性阴道病是一种阴道微生物群落紊乱性疾病,可能与众多的不良后果如早产及感染性疾病等有关,尤其疾病的发生发展与菌群组成和丰度有密不可分的联系。大熊猫的繁殖障碍因素很多,本研究拟通过培养和非培养方法研究大熊猫阴道内微生物,掌握其种群和丰度,为研究微生物在大熊猫繁殖障碍中的作用奠定基础。采用454高通量测序及生物信息学分析方法研究21只大熊猫阴道微生物种类及其优势菌种,同时研究了大熊猫阴道内可培养真菌种群及其部分高丰度真菌生物学特性。结果表明:(1)在21只大熊猫阴道样本中共检测到16 S rRNA优化序列224 110条,共分为6 650个OTUs,23个门,618个属,2 147个种,但其中有3个门,136个属,184个种无法鉴定。在各个不同分类水平上确定了优势种类。优势的门分别是:厚壁菌门(54.44%)、变形菌门(39.13%)、拟杆菌门(5.70%)、放线菌门(4.07%)等;优势的属分别是:链球菌属(21.14%),乳球菌属(13.63%),假单胞菌属(11.62%),肠球菌属(6.64%),罗尔斯通菌属(6.27%);优势菌种分别是解没食子酸巴氏链球菌亚种(14.28%)和双鱼乳球菌(11.79%)等。(2)乳球菌属(13.63%)和肠球菌属(6.64%)和乳酸杆菌属(0.01%)是大熊猫阴道中主要的产乳酸的微生物,最优势的是乳球菌属,乳酸杆菌属只占0.01%,不是大熊猫阴道内优势菌群。(3)在20只大熊猫阴道样本中共检测到真核生物18 S rRNA优化序列155 480条,共分为1 650个OTUs,2个界,14个门,92个属,34种动物(27种虫),70种真菌,27种植物。动物类的序列(98.1%)占优势的分别是:多细胞动物96.64%,扁形动物门1.28%,轮形动物门为0.13%;能鉴定到属的真菌共13个属,优势的分别是马拉色菌属(1.26%)、链格孢属(0.53%)、厚壁菌属(0.07%)、假丝酵母属(0.06%)、毕赤酵母属(0.01%)、耐冷酵母(0.01%)及毛孢子菌属(0.01%);寄生虫分别是Paraschneideria、肾形虫属、簇虫属、隐孢子虫属、鞭毛虫、单鞭毛虫属、内阿米巴属及变形虫等。但是,动物、真菌和植物均有较大部分序列未能分类鉴定,有待进一步研究。(4)通过对10只发情期大熊猫阴道分泌物的真菌培养、形态学和分子生物学鉴定,共鉴定30种不同真菌,包含25种霉菌(83.33%)和5种酵母菌(16.67%)。(5)对大熊猫阴道分离链格孢菌分离株的生物学特性研究表明:链格孢菌分离株培养的最适培养基是玉米琼脂培养基和子囊孢子培养基;其次是马铃薯葡萄糖琼脂培养基、沙氏琼脂培养基和察氏琼脂培养基;最不适宜该分离菌株培养的培养基是改良大米琼脂培养基。该菌在25℃中生长情况最好,在15℃、20℃及30℃中生长情况较差,在35℃环境中几乎不能生长。最适pH为pH6和pH7,在pH8～pH11中生长较差,最差的是pH4和pH5。最适合该菌生长的碳源是淀粉和麦芽糖,其次是葡萄糖、蔗糖和甘油,生长最差的是在乳糖中;在研究该菌生长的氮源中,硝酸钠生长情况最好,其次是草酸铵,在尿素中该菌的生长情况较差,在硫酸铵中几乎不能生长。(6)对大熊猫阴道中分离株链状假丝酵母菌的生物学特性研究表明:链状假丝酵母菌菌体呈椭圆形,在玉米吐温培养基上长出分枝假菌丝和真菌丝,未见厚壁孢子,生长期生长曲线呈非对数,有分段,血清孵化未见芽管。葡萄糖、半乳糖、乙醇同化试验呈阳性,海藻糖、纤维二糖、棉籽糖、肌醇同化呈阴性;麦芽糖、半乳糖发酵试验呈阳性,葡萄糖、乳糖、菊糖、蔗糖发酵试验呈阴性;尿素试验呈阴性;耐放线菌酮试验呈阳性;显色反应呈绿色。本研究较全面掌握了大熊猫阴道内细菌及真核生物的种群、丰度及多样性。通过传统分离培养获得30种真菌,完成部分优势真菌的生物学特性研究。这些研究结果是对前人零星报道大熊猫阴道内可培养微生物种群的大力拓展,填补了大熊猫阴道微生物多样性空白,为提高大熊猫的繁殖率提供基础数据。