环状RNA CDYL通过海绵状吸附miR-665-5p调节成肌细胞分化的机制研究

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背景:哺乳动物的骨骼肌具有在受伤或疾病时进行自我修复和再生的潜力。肌肉修复是一个多步骤过程,包括肌纤维变性,再生和重塑。成肌细胞分化是骨骼肌修复过程中的重要环节,因此,研究成肌细胞分化的潜在机制至关重要。研究报道,microRNA和lncRNA等非编码RNA在肌肉细胞分化过程中发挥了重要的调控作用。最近研究表明,环状RNA(Circular RNA,circRNA)在成肌细胞中广泛表达,提示其可能参与肌肉的生长发育过程。然而,circRNA在成肌细胞分化中研究甚少,其中的作用机制尚不清楚。本研究以circRNA为切入点,深入研究circRNA在肌肉分化过程中的作用及其分子机制,旨为阐明生理、病理情况下肌肉再生机制提供理论依据,同时为肌肉萎缩的临床干预和药物靶点的开发提供基础支撑。方法:利用RT-qPCR技术,检测RNase R或放线菌素D处理C2C12细胞后circCDYL和线性CDYL的表达;采用荧光原位杂交(FISH)检测circCDYL的亚细胞定位;通过RT-qPCR、EdU和CCK8等方法检测circCDYL对成肌细胞增殖的影响;免疫荧光、Western Blot技术检测circCDYL对成肌细胞分化的影响;通过生物信息学分析并找到circCDYL“海绵”吸附的miRNA,及其下游靶基因;通过双荧光素酶报告系统、RT-qPCR、Western Blot、免疫荧光等证明circCDYL的ceRNA机制;通过慢病毒包装,小鼠损伤模型的构建,在小鼠体内过表达或敲降circCDYL后,利用RT-qPCR和Western Blot检测其对小鼠体内分化相关基因的影响;通过对组织切片免疫荧光染色,观察circCDYL对骨骼肌损伤修复的影响。结果:在C2C12细胞分化过程中,circCDYL表达量逐渐上调,证明其在成肌细胞分化过程中发挥着重要作用。circCDYL有环状RNA的特征,且主要分布在细胞质中。过表达circCDYL能够显著抑制成肌细胞的增殖,且与增殖相关基因如Cyclin D1、PCNA的表达显著下调,干扰circCDYL能够促进增殖。此外,过表达circCDYL能够促进成肌细胞的分化,分化标志基因MyoD、MyoG、MyHC的mRNA和蛋白水平显著上调,干扰circCDYL能够抑制分化。通过生物信息学分析,筛选并证明了circCDYL能够通过“海绵”吸附miR-665-5p从而调控成肌细胞的增殖与分化。进一步对miR-665-5p靶点分析,鉴定了其下游靶基因MASTR,并充分证明了circCDYL-miR-665-5p-MASTR三者之间的调控网络。通过小鼠体内实验,证明了circCDYL能够调控小鼠体内分化相关基因的表达,并促进骨骼肌损伤的修复。结论:circCDYL通过“海绵”吸附miR-665-5p从而减弱其对下游靶基因MASTR的抑制作用,进而抑制成肌细胞的增殖,促进其分化和骨骼肌损伤的修复。
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