近年来,感染性疾病包括病毒、细菌的感染日益增多,严重危害人们的生命健康。尤其是近年来各种新发、突发病毒性传染病如流感、埃博拉病毒以及寨卡病毒的感染流行一度引发人们的恐慌。已知免疫系统是抗感染的关键防线,如何认识免疫系统抗感染应答的机制,寻求新的干预策略是迫切需要解决的科学问题;除了单个病原体的威胁,多种病原体如多种生物恐怖剂联合暴露会给人的生命健康带来更大的威胁。尽管现在有疫苗等免疫制剂应对感染的措施,但目前对于如何制定合理有效的应急联合免疫方案,如何在需要应急联合免疫的情况下快速早期评价联合免疫的效果是本领域研究者关注的另一科学问题。本论文主要以抗感染免疫应答的机制及应用为研究内容,对上述两个科学问题进行初步的探索。Tim-3(T-cell-Ig-mucin-3)是最初发现表达于活化的Th1细胞上的免疫负调控分子,与其配体Gal-9结合能够诱导T细胞的凋亡及免疫耐受。随后研究发现Tim-3也表达在活化的Th17、Tc1等效应性T细胞上,其高表达可导致效应细胞内IFN-γ、IL-2等表达降低,使细胞处于失能或耗竭(exhaustion)状态而形成抗感染免疫耐受。鉴于Tim-3高表达与T细胞耐受的关系,靶向Tim-3抗体或Tim-3融合蛋白被认为是治疗HIV、HCV等感染性疾病中T细胞耐受的新手段。Kuchroo VK教授等发现Tim-3可能通过Bat3以及CEACAM-1等转录因子抑制T细胞的功能,近年来我们课题组发现Tim-3也表达在巨噬细胞、NK细胞等天然免疫细胞上,并且发现Tim-3在维持天然免疫稳态中发挥重要作用,但到目前Tim-3在天然免疫上发挥免疫耐受功能的分子机制尚不十分清楚,需进一步阐明。课题组前期发现Tim-3能够抑制LPS/TLR介导的巨噬细胞活化而促进免疫耐受;随后发现Tim-3能够与STAT1相互作用,进而抑制后者入核,最终抑制巨噬细胞的应答功能;另外发现Tim-3通过抑制转录因子Nrf2入核进而抑制巨噬细胞对李斯特菌的吞噬作用;最近课题组发现Tim-3能够通过抑制NOD-样受体蛋白3(NLRP3)的活化,进而抑制炎症反应导致免疫失衡。基于前期Tim-3在固有免疫中的研究,课题组着眼于Tim-3调控固有免疫更多分子机制的研究,旨在进一步解释Tim-3调控固有免疫的潜在分子机制。已知病毒感染哺乳动物细胞过程中,病毒复制产生的基因组或病毒蛋白激活先天性免疫信号通路后,产生干扰素的同时能够诱导干扰素下游基因表达,促进细胞的抗病毒免疫反应;与此同时病毒感染宿主细胞还能引起胞质颗粒的聚集,其成分大多为核糖核蛋白,RNA结合蛋白、翻译起始因子等,这个聚集区域被称之为应激颗粒(stress granules,SG)。先天性免疫通路和SG都是宿主细胞对病毒感染的一种抵抗性反应,而与之相对,一些病毒却通过抑制SG形成和先天性免疫通路的活化来促进自身复制。有意义的是在课题组前期实验过程中,通过免疫共沉淀和质谱筛选技术,我们发现了一种新的与病毒感染相关的分子-核因子90(Nuclear Factor 90,NF90)可以与免疫调控分子Tim-3相互作用。NF90由人白细胞介素增强结合因子3(Interleukin enhancer binding factor 3,ILF3)基因编码,因可变剪接事件的发生导致多种同型异构体形成,使NF90成为一个蛋白家族。有研究报道NF90在生物生长发育过程中发挥关键调控作用,从而确立NF90这一分子的重要地位;研究也发现NF90能够调控多种细胞周期蛋白的功能,从而调节细胞周期进程,这更进一步说明核因子NF90的重要生理作用;近年来,许多研究报道NF90与病毒复制以及抗病毒感染有关系。如有研究报道,NF90在病毒感染中通过促进PKR/eIF2α磷酸化通路进而促进SG的形成,从而抑制病毒的翻译起始,最终发挥抗病毒感染免疫作用。对于NF90分子目前的研究重点有两个方面:其一是该分子如何影响病毒的复制及后续的抗病毒应答,这方面的研究较多,目前认为的机制有:1):NF90通过结合病毒RNA中特定结构域从而抑制病毒的特定周期,使病毒复制减弱;2)NF90能够通过dsRBD结构域与病毒的核心蛋白元件相互作用,从而拮抗病毒蛋白对下游信号分子的抑制作用;3):NF90是应激性颗粒(stress granules,SG)的重要组成成分,NF90通过促进SG的形成从而抑制病毒mRNA的翻译起始,最终使病毒复制减弱。但仍有很多不清楚的问题。其二是NF90自身是如何被调控的,其发挥抗病毒感染的功能变化如何,这方面的研究尚有很多的空白。本论文重点针对第二个方面的问题开展了研究。基于有关NF90在病毒感染免疫调控中发挥重要作用的介绍,以及Tim-3在固有免疫调控中的前期研究,我们对Tim-3调控NF90抗病毒感染免疫的分子机制进行了深入探究。利用水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)作为病毒感染模型,先后感染稳定敲低Tim-3的RAW264.7巨噬细胞(Tim-3-si),以及全基因敲除的C57BL/6Tim-3-KO小鼠腹腔巨噬细胞,并以相应的野生型巨噬细胞和小鼠腹腔巨噬细胞作为对照,发现在VSV病毒感染状态下:1)敲低或敲除Tim-3后NF90基因和蛋白水平都明显上升;2)敲低或敲除Tim-3后VSV的复制受到了抑制;以上结果提示在病毒感染刺激下,Tim-3可能通过抑制NF90介导感染耐受,同时证明Tim-3参与并促进病毒的感染。然后我们对Tim-3抑制NF90抗病毒感染的分子机制进行更深入的研究,通过实验发现了NF90功能调控的新机制,即存在泛素化修饰。我们通过在细胞系高表达Tim-3,以及利用Tim-3转基因小鼠腹腔巨噬细胞等多个实验体系证明Tim-3能够促进NF9-Ub-K48的泛素化修饰;并且进一步实验发现NF90-DZF-Domain是发生泛素化修饰的结构域,并证明了Tim-3能够与DZF-Domain发生免疫共沉淀并促进其泛素化修饰;通过免疫共沉淀技术初步确认Tim-3-IC胞内段是发挥免疫负调控作用的结构域。在发现NF90的泛素化修饰这一新的修饰功能后,课题组进一步筛选调控NF90翻译后修饰的E3泛素连接酶,并通过基因芯片和RT-PCR以及免疫沉淀等技术发现TRIM16、TRIM47以及TRIM59可能是调控NF90泛素化修饰的E3泛素连接酶。我们在这部分研究中发现了NF90的一种新修饰方式-泛素化修饰,并通过实验证明Tim-3调控NF90泛素化修饰的具体结构域,但仍有许多问题需要课题组进一步探究。首先,Tim-3是膜蛋白,而NF90主要位于核内,病毒活化后Tim-3及NF90亚细胞定位是课题组迫切需要回答的问题,这一问题解决将为Tim-3抑制NF90抗病毒感染精细的分子机制研究奠定基础;其次,Tim-3与NF90和E3链接酶之间相互作用的机制需要进一步验证;再者,NF90-DZF-Domain中发生泛素化修饰的精确赖氨酸位点成为课题组下一步要探究的问题;最后,在病毒感染状态下,Tim-3-IC胞内段发挥调控作用的精确氨基酸残基及其修饰功能也需要课题组进一步探究和证明。在另一部分研究工作中,我们基于巨噬细胞的表型变化(M1或M2偏离)探索了一种新的联合免疫效果早期评价方法。已知巨噬细胞在抗感染免疫应答中处于一线防御地位。我们前期的结果以及文献研究发现巨噬细胞的极化方向与疾病的发生发展密切相关。如在肿瘤、慢性感染等情况下巨噬细胞向具有免疫抑制功能的M2方向极化,而在自身免疫损伤性疾病中向促进炎症反应的M1方向极化。鉴于此,巨噬细胞也成为疾病干预的靶细胞。另外,我们前期研究的结果证实了巨噬细胞的极化受到Tim-3分子的调控并初步阐明了其信号通路,为该细胞的调控机制提供了新的依据。为了进一步明确该细胞在抗感染免疫中的潜在作用,我们建立了鼠疫和布氏杆菌联合免疫小鼠模型,通过对小鼠早期巨噬细胞极化及表型的分析以及晚期反应抗感染应答能力的T细胞表型的分析发现,联合免疫早期巨噬细胞表型与后期能反映抗感染免疫应答能力的CD8~+T细胞表型及功能出现一致性变化,提示通过检测巨噬细胞表型可用于早期快速评价联合免疫的效果。该研究结果为我们在应急情况下快速评价联合免疫的效果提供了新方法。