【摘 要】
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曲拉是牦牛乳脱脂后,自然条件下微生物发酵产酸,使酪蛋白凝固、结块、风干后的产品。为探究曲拉干酪素酶解液的抗氧化活性及抗氧化肽的分离纯化,本文以曲拉干酪素为原料,通过生物酶酶解、超滤、凝胶色谱、反相高效液相色谱以及质谱等方法,对其酶解参数、酶解液体外抗氧化活性、抗氧化肽的分离纯化及结构进行了较为详尽的研究,旨在为开发牦牛曲拉抗氧化肽功能性产品提供依据。本研究主要结果如下:1、双酶酶解条件的优化。采用
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曲拉是牦牛乳脱脂后,自然条件下微生物发酵产酸,使酪蛋白凝固、结块、风干后的产品。为探究曲拉干酪素酶解液的抗氧化活性及抗氧化肽的分离纯化,本文以曲拉干酪素为原料,通过生物酶酶解、超滤、凝胶色谱、反相高效液相色谱以及质谱等方法,对其酶解参数、酶解液体外抗氧化活性、抗氧化肽的分离纯化及结构进行了较为详尽的研究,旨在为开发牦牛曲拉抗氧化肽功能性产品提供依据。本研究主要结果如下:1、双酶酶解条件的优化。采用单因素及响应面试验对曲拉干酪素酶解工艺条件进行优化,并对酶解液的水解度及抗氧化活性进行比较。结果表明,底物质量浓度为60g/L,碱性蛋白酶酶解时间3.8h、酶解温度49.8℃、p H值8.5、酶添加量140U/g;胰蛋白酶酶解时间2.5h、酶解温度47.8℃、p H值7.5、酶添加量2900U/g时,水解度可达到31.09%。酶解液O2-·、·OH、DPPH清除率,Fe2+、Cu2+螯合能力和还原力在浓度1mg/m L时分别为76.34%、69.47%、45.42%、39.60%、48.89%、0.50。2、抗氧化物质分离纯化。采用分子量截留值（MWCO）为12、6和3k Da的中空纤维膜超滤,获得了四个分子量（MW）为>12k Da（QCH-1）、6-12k Da（QCH-2）、3-6k Da（QCH-3）和<3k Da（QCH-4）的截留段;回收的冻干QCH样品,经各级分的抗氧化活性测定,<3k Da为抗氧化能力最高的组分。通过凝胶色谱Sephadex G-25柱将<3k Da分离成6个级分（P-1、P-2、P-3、P-4、P-5、P-6）,经测定抗氧化能力最高的组分为P-4。通过半制备RP-HPLC对P-4所分离的16个组分的自由基清除率测定,抗氧化活性最强的组分为P-4-8,经分析型RP-HPLC鉴定,P-4-8为单一峰。3、抗氧化物质结构。利用LC-MS/MS对组分P-4-8进行结构鉴定,获得了6种肽序列:Gly-Lys-Glu-Lys-Val-Asn-Glu-Leu（GKEKVNEL）、Arg-Glu-Leu-Glu-Glu-Leu（RELEEL）、Leu-Pro-Val-Pro-Gln（LPVPQ）、His-Pro-His-Pro-His-Leu（HPHPHL）、Val-Leu-Pro-Val-Pro（VLPVP）、Val-Pro-Tyr-Pro-Gln（VPYPQ）,与生物学信息库NCBI、Bio Pep DB抗氧化肽比较,各氨基酸序列与已知乳源的抗氧化肽具有高度的相似性。4、合成肽抗氧化活性。依据被鉴定肽序列,采用固相化学合成法合成了肽,丰度值最高的目标肽段为Arg-Glu-Leu-Glu-Glu-Leu（RELEEL）;抗氧化活性测定表明,该肽段在浓度0.5mg/m L时具有良好的抗氧化活性,其O2-·及·OH自由基清除率分别为48.28%和36.20%。研究结果表明,曲拉干酪素酶解液具有良好的抗氧化性,能够进一步分离纯化抗氧化肽,研究结果为干酪素进一步开发利用奠定了基础。
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