当前,动物疫病防控急需新型抗病毒制剂和免疫增强剂。近年来的研究发现,多糖具有抗病毒、增强免疫、抗凝血等生物活性,硫酸化修饰可以进一步提高多糖的生物活性并产生许多新的药用价值。临床上,应用中药防治疾病主要以复方为主。因此,本研究首先提取制备了七种中药多糖及其硫酸化多糖,以三种配比配制126个多糖-硫酸化多糖复方,通过体外抗病毒试验初步筛选出五个作用较强的组方,进一步通过体外、体内试验比较五种组方的抗病毒和增强免疫活性,筛选出抗病毒和增强免疫活性最强的复方SP9-sCP1,并研究了该方的作用机理。本研究的目的,旨在筛选抗病毒和增强免疫活性最强的多糖-硫酸化多糖复方,并探讨其作用机理,为研制多糖类抗病毒制剂和免疫增强剂提供理论依据。试验分为以下七个部分:试验Ⅰ、七种中药多糖及其硫酸化多糖的制备首先用水煎醇沉法分别从淫羊藿、黄芪、党参、当归、黄精、大蒜及板蓝根中提取七种中药多糖,淫羊藿多糖(EP)、黄芪多糖(AP)、党参多糖(CP)、当归多糖(CA)、黄精多糖(SP)、大蒜多糖(GP)及板蓝根多糖(IP),用硫酸-苯酚法测定其糖含量;采用本研究室以前优化的修饰条件分别用氯磺酸-吡啶法进行硫酸化修饰,得到七种硫酸化多糖,sEP、sAP、sCP、sCA、sSP、sGP及sIP,分别用硫酸-苯酚法测定其糖含量,用超声-酸性铬酸钡法测定其硫酸根含量,用红外光谱鉴定其结构。结果显示,七种中药多糖的糖含量在47.31～93.39%;七种硫酸化多糖的含量在29.63～77.30%、硫酸根含量在31.23～43.63%、红外光谱显示有S=O和C-O-SO3基团的特征吸收峰,表明各硫酸化多糖修饰成功。试验Ⅱ、多糖-硫酸化多糖复方抗病毒活性的比较为了筛选抗病毒的活性最好的复方,首先用MTT法测定淫羊藿多糖(EP)、黄芪多糖(AP)、党参多糖(CP)、当归多糖(CA)、黄精多糖(SP)、大蒜多糖(GP)及板蓝根多糖(IP)七种多糖及其硫酸化多糖对鸡胚成纤维细胞(CEF)的安全浓度;然后将多糖(PS)与硫酸化多糖(sPS)两两组合,分别按其糖含量比为 9:1(PS9-sPS1)、7:3(PS7-sPS3)、6:4(PS6-sPS4)三种比例共组成126个复方,取安全浓度范围内5种浓度的各多糖复方,与鸡新城疫病毒(NDV)以先加病毒后加多糖的方式加入到培养成单层的CEF中,用MTT法测定NDV感染CEF能力的变化。结果显示,最高病毒抑制率位于前五位的复方组依次为 CP7-sCA3(86.90%)、EP7-sAP3(82.00%)、SP9-sCP1(78.30%)、EP7-sCA3(77.10%)、CA9-sEP1(65.80%),可以初步作为抗病毒复方的候选方。试验Ⅲ、多糖-硫酸化多糖复方抗病毒活性的验证为了验证前一试验筛选出的5个组方的抗病毒活性,将5个组方再分别按多糖(PS)与硫酸化多糖(sPS)的糖含量比9:1、7:3、6:4三种配比组成15个复方,用MTT法比较它们的体外抗病毒活性。结果显示,SP9-sCP1、CP7-sCA3、EP7-sAP3、CA9-sEP1和EP7-sCA3 分别在同方的 3 个配比中的抗病毒活性最强;SP9-sCP1在15个复方中的病毒抑制率最高,可以作为抗病毒方剂。然后分别用透射电镜、间接免疫荧光试验法和流式细胞技术观察三种浓度的SP9-sCP1对NDV的结构、NDV感染CEF后的抗原表达和细胞凋亡的影响。结果显示,SP9-sCP1能直接破坏NDV的结构,且有明显的时-效和量-效关系;显著降低NDV的抗原表达;显著减轻NDV引起的CEF病变程度,调控细胞周期分布,抑制细胞凋亡,高剂量的作用最为显著。结果表明,SP9-sCP1具有杀灭病毒、抑制病毒感染和细胞保护作用。试验IV、多糖-硫酸化多糖复方增强免疫活性的比较为了筛选体外增强免疫活性最好的复方,将五个多糖-硫酸化多糖复方(SP9-sCP1、CP7-sCA3、EP7-sAP3、CA9-sEP1及EP7-sCA3)自安全浓度倍比稀释至共5个浓度,分别单独或与PHA 一起加入到鸡外周血淋巴细胞的培养体系中,培养48h后,用MTT法测定淋巴细胞增殖的变化。结果显示,多糖复方单独刺激时,SP9-sCP1、CP7-sCA3、EP7-sAP3及CA9-sEP1组在7.813～0.488 μg·mL-1、EP7-sCA3 组在 3.906～0.488 μg·mL-1 能显著促进淋巴细胞增殖(P<0.05);SP9-sCP1组的增殖率最高(37.13%),显著高于其余四个复方组(P<0.05)。多糖复方与PHA同时刺激时,五个复方组在一定浓度下能协同PHA显著促进淋巴细胞增殖。SP9-sCP1组的增殖率最高(24.31%),显著高于其余四个复方组(P<0.05)。以上结果表明,SP9-sCP1组的增强免疫活性最好,显著优于其余四个复方。试验V、多糖-硫酸化多糖复方增强免疫活性的验证为了筛选体内增强免疫活性最好的复方,取16日龄非免疫健康雏鸡210只随机均分为7组,除空白对照组外用新城疫疫苗免疫,30日龄二免。在首次免疫的同时,5个多糖复方组分别肌肉注射5 mg·ml-1 的 SP9-sCP1、CP7-sCA3、EP7-sAP3、CA9-sEP1、EP7-sCA3 药液 0.5ml,免疫对照组和空白对照组注射等量生理盐水。分别于首免后7、14、21、28 d采血测定外周血淋巴细胞增殖、血清ND抗体效价、血清IL-2、IL-6及IFN-γ的含量。淋巴细胞增殖结果显示,在 D7、D28,SP9-sCP1、CP7-sCA3、EP7-sAP3 及 CA9-sEP1 组的淋巴细胞A570值显著高于免疫对照组(P<0.05);在D14,SP9-sCP1、CP7-sCA3及EP7-sAP3组的淋巴细胞A570值均显著高于免疫对照组(P<0.05);在D21,SP9-sCP1及EP7-sAP3组的淋巴细胞A570值均显著高于免疫对照组(P<0.05);其中SP9-sCP1组的平均淋巴细胞增殖率最高(49.85%)且显著高于其余组(P<0.05)。在D7～D28,五种复方均能提高血清抗体效价,SP9-sCP1组均为最高,显著高于免疫对照组(P<0.05);五种复方均能提高血清IL-2、IL-6和IFN-γ的含量,SP9-sCP1组均为最高,显著高于免疫对照组(P<0.05)。以上结果表明,5个复方在合适的浓度均能促进淋巴细胞增殖、提高血清抗体效价、提高血清IL-2、IL-6及IFN-γ的含量,SP9-sCP1的作用最为显著。试验Ⅵ、SP9-sCP1对NDV NP mRNA表达的影响为了探讨SP9-sCP1抗病毒的作用机理,培养鸡胚成纤维细胞(CEF),用NDV感染,分别加入三种浓度的SP9-sCP1(7.813、3.906、1.953μg·mL-1),并设细胞对照组及病毒对照组,培养48 h后,提取Total RNA,反转录成cDNA,以2.5%琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增产物特异性,运用荧光定量RT-PCR方法测定NDV NP的mRNA表达的变化。结果显示,PCR扩增产物具特异性,无非特异性扩增产物。SP9-sCP1能明显抑制NPmRNA的相对表达量,三个剂量组NP mRNA的相对表达倍数均显著低于病毒对照组(P<0.05),SP9-sCP1H组最低。结果表明,SP9-sCP1能显著下调NPmRNA的表达,且具有一定的量-效关系。试验Ⅶ、SP9-sCP1对鸡淋巴细胞中IL-2、IL-6和IFN-γ的mRNA表达的影响为了探讨SP9-sCP1增强免疫作用的机理,将三种浓度的SP9-sCP1(7.813、3.906、1.953μg.mL-1)加入到鸡外周血淋巴细胞的培养体系中,培养12 h后,提取淋巴细胞Total RNA,反转录成cDNA,用荧光定量RT-PCR方法测定IL-2、IL-6和IFN-y的mRNA表达的变化。结果显示,与细胞对照组相比,SP9-sCP1在7.813、3.906μg.mL-1显著上调 IL-2 mRNA 的表达,在 7.813 μg.ml-1 显著上调 IL-6 mRNA 的表达,在 7.813、3.906、1.953 μg·mL-1显著上调IFN-γ mRNA的表达(P<0.05)。结果表明,SP9-sCP1能显著上调IL-2、IL-6和IFN-γ的mRNA的表达,从而增强免疫。