【摘 要】
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大熊猫是我国特有的国家I级濒危珍稀野生保护动物,也是世界生物多样性保护的象征和旗舰物种。在过去的20年里,中国学者围绕大熊猫的血液生理生化指标开展了多项研究,但生理生化指标随年龄变化的调控机制尚未被报道。因此,本研究以幼年、成年和老年三个年龄阶段的大熊猫血液组织为研究对象,探究不同年龄阶段大熊猫血液生理生化指标的变化规律;利用RNA-Seq和WGBS技术,构建大熊猫三个不同年龄阶段血液转录组和甲基
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大熊猫是我国特有的国家I级濒危珍稀野生保护动物,也是世界生物多样性保护的象征和旗舰物种。在过去的20年里,中国学者围绕大熊猫的血液生理生化指标开展了多项研究,但生理生化指标随年龄变化的调控机制尚未被报道。因此,本研究以幼年、成年和老年三个年龄阶段的大熊猫血液组织为研究对象,探究不同年龄阶段大熊猫血液生理生化指标的变化规律;利用RNA-Seq和WGBS技术,构建大熊猫三个不同年龄阶段血液转录组和甲基化图谱,筛选幼年、成年和老年阶段差异表达及差异甲基化的基因及其功能。主要研究结果如下:1.三个年龄阶段(幼年、成年和老年)大熊猫血液血液生理生化指标分析结果发现,白细胞、嗜中性粒细胞计数和血红蛋白浓度在幼年、成年、老年呈现出先上升后下降的趋势,表明大熊猫的免疫功能从幼年到成年逐渐完善,但从成年到老年逐渐降低;血清钠和血清氯含量均随着年龄增长逐渐降低,并且谷草转氨酶和谷氨酰转肽酶在成年和老年组显著上升(P<0.05),表明随着年龄的增长炎症发生逐渐增加并累积;葡萄糖代谢水平逐渐降低,且与幼年大熊猫相比,老年大熊猫血液中葡萄糖代谢的下降程度达到显著水平(P<0.05)。2.利用RNA-Seq技术构建了三个不同年龄阶段大熊猫血液的转录组图谱。幼年vs.成年、成年vs.老年、幼年vs.老年大熊猫间分别鉴定到了716、373、1133个差异表达基因。幼年vs.成年阶段CXC家族、白介素家族和肿瘤坏死因子家族基因的差异表达可能是影响大熊猫免疫功能变化的关键因素;大熊猫成年vs.老年阶段的免疫功能变化可能与补体与凝血系统级联通路有关。三个不同年龄阶段差异基因表达水平的变化趋势显示,趋化因子CXCL12可能是影响大熊猫生命周期中免疫功能变化的重要基因。3.基于WGBS技术构建的大熊猫血液全基因组单碱基分辨率的DNA甲基化表达谱显示,CG是大熊猫血液甲基化的主要类型,极少部分发生在CHG和CHH序列上;不同年龄阶段的DNA甲基化水平分布模式相似:在CG序列环境下,内含子和3’UTR中的DNA甲基化水平较高,其次是CGIshore、重复和外显子区域,而启动子区域的DNA甲基化水平最低。4.通过分析不同年龄阶段大熊猫血液的DNA甲基化变化规律发现在CG序列环境下,DNA甲基化水平随大熊猫年龄增长而降低。幼年vs.成年、成年vs.老年以及幼年vs.老年组大熊猫间分别鉴定到4273、6544和8834个差异甲基化区域(DMR),分别对应到448、750、851个差异甲基化基因(DMG)。功能富集分析显示,幼年vs.成年组间的DMGs主要富集代谢和免疫相关的通路上,成年vs.老年间的DMGs主要富集到疾病相关的通路上,幼年vs.老年组间的DMGs可能主要通过C型凝集素受体通路和皮质醇合成与分泌通路影响大熊猫的免疫和代谢功能。5.血液DNA甲基化与转录组联合分析表明,在幼年vs.成年、成年vs.老年、幼年vs.老年组分别发现了19、17、41个既差异表达又差异甲基化的基因;功能富集分析结果显示,这些基因主要与免疫和代谢相关,表明DNA的甲基化可能通过调控基因的表达从而影响不同年龄阶段大熊猫的免疫和代谢功能。进一步分析启动子区域差异甲基化的基因及其与基因表达的调控关系发现,在大熊猫幼年vs.成年阶段,RAPGEF3基因启动子Cp G岛区域的甲基化水平的变化可能抑制了RAPGEF3基因的表达,进而间接调控CXC基因家族基因的表达。综上,血液DNA的甲基化可能通过调控基因的表达参与了机体免疫和代谢功能的变化。其中,RAPGEF3基因的甲基化可能在幼年至成年阶段扮演着较为重要的角色,研究的结果为大熊猫的表观遗传学研究及大熊猫的保护等提供了理论参考。
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