引言胃癌是我国常见的消化道恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率位居第二位。在某些农村及经济不发达地区,胃癌甚至已经超过了肺癌,成为威胁人民健康的头号癌种。在胃癌早期筛查普及率不高的地区,由于胃癌的症状不明显,不易被早期诊断,多数患者到医院就诊时已是晚期,治疗后的五年生存期不高。胃癌的复发和转移大大制约了胃癌患者生存期的延长。侵袭转移是胃癌治疗的难点,胃癌细胞的侵袭转移需要经历一系列的生物学特性的改变,包括上皮间质转化、伪足形成、侵袭转移相关因子和酶的分泌。而肿瘤细胞骨架重塑,在介导肿瘤细胞获得侵袭转移能力的过程中发挥了重要作用。肿瘤细胞骨架重塑,是肿瘤细胞在运动过程中,细胞骨架中的纤维状微丝和球状微丝重新拆分组装,形成新的细胞骨架结构,其形态发生了变化(包括伪足形成),使得肿瘤细胞易于迁移。肿瘤细胞通过重塑骨架来实现由上皮细胞形态向间质细胞形态的转变,同时重塑细胞边缘的骨架,形成具有极性的片状伪足和丝状伪足的结构。在细胞收缩力的作用下,不断重复着向前伸出突起,牵拉后方胞体不断循环前进,完成细胞的侵袭转移。由此可见,胃癌细胞骨架重塑参与了胃癌侵袭转移的多个环节,胃癌细胞骨架重塑率直接影响肿瘤细胞的迁移能力,是胃癌侵袭转移的结构基础和前置条件。南蛇藤,是卫矛科南蛇藤属植物,药性辛温,其根、茎、叶、果实、种子均可入药。从其根皮、茎、叶、种子等部位分离到多种成分,具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒等活性作用。课题组长期从事中药南蛇藤提取物(Celastrus orbiculatus extract,COE)(专利授权号:200710025343.3)抗肿瘤的药效学研究。前期研究结果发现该药可抑制肿瘤细胞的侵袭转移和EMT进程,但是细胞骨架重塑在介导COE抑制胃癌侵袭转移中的具体作用机制还不完全清楚。为此,本研究拟在前期研究基础上,从分子水平上深入探讨COE通过CFL1抑制胃癌侵袭转移的机制。同时建立高度拟合临床胃癌环境的原位移植瘤动物模型,进一步探讨COE的体内抗胃癌侵袭转移的效果及作用机制,对其进一步开发利用具有重要意义。本课题分为如下三部分研究内容。第一部分CFL1在人胃癌细胞骨架重塑中作用及调控机制的研究目的:研究胃癌细胞侵袭转移的生物学结构基础--细胞骨架重塑的调控机制;探讨CFL1在胃癌细胞骨架重塑中的关键调控作用;明确CFL1在胃癌细胞骨架重塑中关键调控环节,阐明CFL1参与胃癌细胞骨架重塑的调控机制为开发抗胃癌侵袭转移的药物寻找生物学靶点。方法:正常培养胃癌细胞BGC-823和AGS,给予TGF-β 15ng/mL诱导胃癌细胞的表型发生变化,观察此过程中细胞骨架发生的变化。运用western blot和PCR来验证慢病毒的表达和干扰情况。运用MTT法检测CFL1对胃癌细胞的增殖及细胞活力的影响。通过细胞骨架染色联合免疫荧光染色,观察经TGF-β诱导细胞骨架重塑的细胞中CFL1的表达情况,以及CFL1与细胞骨架重塑活跃度之间的关系。TGF-β 15ng/mL进行诱导胃癌细胞24小时后,运用激光共聚焦显微镜观察不同CFL1表达程度的细胞骨架中的微管和微丝的变化差异,观察细胞中肌动蛋白的解聚和聚合情况。分别提取不同CFL1表达程度的胃癌细胞骨架中的F-actin和G-actin蛋白,用western blot来检测。透射电镜用来检测和观察CFL1表达不同的细胞内部骨架中的超微结构的变化。场发射扫描电镜被用来检测和观察不同CFL1表达的细胞表面超微结构的变化,包括片状伪足和丝状伪足的变化。结果:TGF-β可以诱导胃癌的细胞中的微丝和微管发生解聚和重排即细胞骨架重塑。TGF-β诱导胃癌细胞后细胞形态发生很大变化。丝状伪足和片状伪足的形成证明了细胞的骨架在TGF-β诱导后发生了重塑。MTT结果显示,无论CFL1表达被降低还是升高,对胃癌细胞的增殖影响均无显著差异。经TGF-β诱导后细胞发生骨架重塑的胞质内的CFL1的表达明显增强,CFL1表达水平的增加伴随着细胞片状伪足和丝状伪足的形成。激光共聚焦显微镜对细胞微管结构进行观察发现,TGF-β可以显著促进细胞内肌动蛋白的活性。在Lv-siRNA-CFL1组中细胞骨架中的肌动蛋白从细胞质富集到了细胞膜上。Western blot结果显示,TGF-β诱导后,Lv-NC组的F-肌动蛋白和G-肌动蛋白表达水平均增加了,但是Lv-siRNA-CFL1组中F-actin的表达较LV-NC组明显增高了,G-actin的表达明显减少了。透射电镜超微结构观察结果显示TGF-β处理组细胞胞浆和细胞膜微丝数均多于Lv-NC组。在相同的诱导条件下,Lv-siRNA-CFL1组的微丝数量也有所增加,但大多数微丝集中在细胞膜上,通过G-actin聚合成F-actin,F-actin显著增加。场发射扫描电镜结果亦显示CFL1被低表达后细胞的丝状伪足减少,细胞片状伪足面积变大,但是数量在减少。结论:TGF-β可以诱导胃癌细胞骨架发生重塑;CFL1低表达和过表达对于胃癌细胞的增殖没有明显影响;CFL1参与胃癌细胞的骨架重塑;CFL1的低表达,可以抑制胃癌细胞的重塑率,降低胃癌细胞丝状伪足的形成;CFL1是细胞骨架重塑的关键调控因子之一。第二部分CFL1调控的细胞骨架重塑在胃癌细胞上皮间质转化和侵袭转移中的作用及机制研究目的:研究CFL1介导的细胞骨架重塑在胃癌细胞EMT、侵袭转移和粘附中的作用,阐明细胞骨架重塑如何参与胃癌细胞EMT和侵袭转移的分子机制,明确胃癌细胞骨架重塑如何影响细胞粘附的机制,阐明细胞骨架重塑参与细胞运动结构基础,为寻找和开发以CFL1为切入点的抗胃癌转移药物奠定试验基础。方法:Western blot实验和PCR实验用来检测不同胃癌细胞系和胃癌样本中CFL1的蛋白含量和CFL1的mRNA表达情况。胃癌细胞,给予TGF-β 15ng/mL诱导胃癌细胞上皮间质转化,观察此过程中细胞形态学变化以及细胞骨架发生的变化,同时提取不同组细胞的蛋白,用western blot方法检测EMT相关标志蛋白以及CFL1在此过程的表达的情况。细胞骨架染色联合免疫荧光染色用来观察经TGF-β诱导细胞骨架重塑的细胞中CFL1的表达情况,以及CFL1与细胞骨架重塑活跃度之间的相关性。Western blot方法被用来检测相同诱导条件下Lv-siRNA-CFL1细胞与Lv-NC细胞中EMT相关蛋白的表达情况。Transwell小室实验用来检测Lv-siRNA-CFL1细胞和Lv-NC细胞的侵袭转移能力。裸鼠腹膜移植瘤模型用来检测Lv-siRNA-CFL1细胞和Lv-NC细胞在裸鼠腹腔的转移能力。肠系膜解剖用来直观观察不同组细胞在裸鼠体内的转移情况。细胞原位移植瘤模型用来检测Lv-siRNA-CFLl细胞和Lv-NC细胞在裸鼠胃壁的真实种植及生长情况。结果:Western blot和PCR结果显示与正常胃粘膜GES细胞组比较,胃癌细胞组中CFL1蛋白和mRNA的表达明显增高。66对样本中有51对CFL1蛋白在胃癌组织中显著高表达(77.27%),CFL1 mRNA高表达的有52个(78.78%)。经TGF-β15ng/mL诱导24 h后胃癌细胞的生长形态发生了明显变化,细胞由原来不规则四边形变成了梭形,细胞边缘伸出了触角,细胞EMT相关蛋白发生了明显变化,E-cadherin 的表达降低了(P<0.001),N-cadherin,Vimentin 和 CFL1 的表达都升高了(P<0.001)。免疫荧光和细胞骨架联合染色可以清楚地看到经TGF-β诱导后细胞胞质内的CFL1的表达明显增强。激光共聚焦显微镜对细胞微管结构进行观察发现,发生EMT的细胞周边伸出了片状伪足和丝状伪足。Western blot结果发现,相同诱导条件下Lv-siRNA-CFL1细胞与Lv-NC细胞中EMT相关蛋白的表达发生了显著变化,Lv-siRNA-CFL1组细胞E-cadherin的表达升高了(P<0.01),N-cadherin,Vimentin 和 Snai1 蛋白的表达都降低了(P<0.01)。Transwell 实验显示,与Lv-NC组相比,Lv-siRNA-CFL1组穿透膜的细胞数明显减少。小动物活体成像结果显示Lv-siRNA-CFL1组细胞的荧光数量明显小于对照组。解剖后的腹膜照片显示,Lv-siRNA-CFL1组细胞在腹膜上的成瘤数量明显少于对照组的细胞成瘤数。原位细胞移植瘤实验显示,CFL1敲低组细胞在胃壁上的成瘤体积明显小于Lv-NC 组。结论:CFL1的蛋白和mRNA在胃癌细胞系中高表达,CFL1在胃癌临床样本中的多数高表达,高表达率在77.27%,mRNA高表达率在78.78%。TGF-β诱导胃癌发生EMT后CFL1高表达,CFL1参与了胃癌的EMT过程,细胞发生EMT的过程中CFL1明显高表达,细胞骨架也发生了剧烈变化。敲低CFL1可以抑制胃癌细胞EMT的进程,抑制胃癌细胞的侵袭转移。体内实验说明,敲低CFL1可以抑制胃癌细胞的腹膜转移和原位移植瘤的种植生长。第三部分CFL1介导的细胞骨架重塑在南蛇藤提取物抑制人胃癌侵袭转移中的作用及机制研究目的:探讨南蛇藤提取物通过CFL1抑制胃癌细胞骨架重塑的分子机理,明确南蛇藤提取物通过CFL1介导的细胞骨架重塑抑制胃癌侵袭转移的分子机制,为寻找和开发以CFL1为靶点的抗胃癌转移的中药奠定实验基础。方法:运用MTT法检测不同浓度COE作用24 h后,细胞的活力。运用流式细胞技术检测COE对胃癌细胞增殖和凋亡的吧影响。以JC-1为荧光探针,检测COE作用胃癌细胞后细胞的线粒体膜电位进行检测。细胞凋亡相关蛋白和细胞增殖相关蛋白用western blot进行检测。透射电镜用来检测COE对胃癌细胞内部结构以及微管结构的影响。Western blot和PCR技术用来检测COE对CFL1蛋白以及mRNA的影响。同时联合使用MG132蛋白酶体抑制剂观察表COE对CFL1蛋白质降解的影响。激光共聚焦显微镜观察胃癌细胞的形态学变化和微丝微管的变化。Transwell实验用来检测COE对胃癌细胞侵袭转移能力的影响。Western blot和PCR技术用来检测COE对胃癌细胞侵袭转移相关(MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-3)蛋白和mRNA的表达情况进行检测。明胶酶谱实验用来检测COE对MMP-2和MMP-9的活性的影响。用western blot对其侵袭转移(MMP-2和MMP-9)和 EMT 相关蛋白(N-cadherin、vimentin 和 E-cadherin)变化进行检测。细胞骨架染色和黏着斑FAK免疫染色用来检测COE对胃癌细胞运动粘附因子的影响。裸鼠皮下移植瘤模型试验用来观察COE对胃癌裸鼠皮下移植瘤的影响。透射电镜用来观察COE对胃癌细胞骨架中的超微结构的变化,如微管和微丝的分布及变化。结果:MTT结果显示COE作用胃癌细胞后,细胞的活力明显下降了(P<0.05)。流式细胞检测结果显示COE处理过后,胃癌细胞的增殖能力明显下降(P<0.01)。Annexin V-FITC染色实验检测结果显示,COE处理过后,胃癌细胞的凋亡增加了(P<0.01)。线粒体膜电位检测实验显示,COE处理过后J-aggregates明显减弱,monomer明显增强了。Western blot结果显示,经过COE处理的胃癌细胞中,PI3k,Akt,mTOR,p70s6k、BCL-2 和 BCL-xL 蛋白显著降低(P<0.05),Caspase-3 和Bax表达显著增高(P<0.05)。透射电镜结果发现,COE作用于胃癌细胞后,细胞体积变小,细胞核缩小,染色体断裂。细胞质内出现空泡。COE处理的细胞线粒体结构破坏。COE作用胃癌细胞后,细胞周围微丝数量减少或消失,细胞骨架部分溶解或断裂。Transwell实验显示,经COE处理过的胃癌细胞,穿过膜的细胞数量都明显减少(P<0.05)。COE作用于Lv-NC组和Lv-siRNA-CFL1组细胞后,Lv-siRNA-CFL1组穿膜细胞数明显减少(p<0.001)。Western blot结果表明,胃癌细胞经过COE作用后,与阴性对照组相比较,TIMP-1、TIMP-3蛋白的表达水平明显升高(P<0.05);MMP-2、MMP-9蛋白的表达明显降低(P<0.05)。PCR结果显示,MMP-2和MMP-9的mRNA有轻微增高的趋势,但是没有显著统计学意义(P>0.05),而TIMP-1和TIMP-3的mRNA出现了显著的增高(P<0.05)。明胶酶谱结果发现,COE可以明显抑制胃癌细胞的MMP-2和MMP-9的活性。Western blot 结果表明,COE 处理胃癌细胞后,CFL1、N-cadherin、Vimentin、MMP-2和MMP-9蛋白表达随COE浓度的增加而明显下降(P<0.05),而E-cadherin蛋白表达水平升高(P<0.05)。细胞骨架染色和黏着斑FAK免疫染色结果显示,TGF-β诱导后的胃癌细胞表面黏着斑FAK表达强烈,经COE处理后的胃癌细胞表面黏着斑表达明显减少。裸鼠皮下移植瘤实验显示,经COE灌胃处理后的裸鼠皮下移植瘤体积明显减小(P<0.05)。透射电镜结果显示,阴性对照组细胞骨架微丝主要分布在细胞质和细胞膜中。TGF-β组细胞骨架微丝主要分布于细胞膜。COE处理后,细胞骨架微丝主要分布在细胞质中,少量细胞微丝分布在细胞膜上。结论:COE可以明显抑制胃癌细胞的增值活力,促进胃癌细胞的凋亡。其机制可能是通过破坏线粒体骨架结构,改变线粒体膜电位来实现促凋亡的。COE可以明显抑制胃癌细胞中的CFL1表达水平,其机制可能是通过促进CFL1的降解来实现的。COE可以明显抑制胃癌细胞的EMT和侵袭转移,其机制很可能是通过抑制CFL1介导的细胞骨架重塑来抑制胃癌细胞的运动结构基础,达到抑制胃癌细胞侵袭转移的目。