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背景狼疮性肾炎(Lupus nephritis,LN)是系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)最常见的并发症,最终进展为终末期肾脏病(End-stage renal disease,ESRD),而肾脏纤维化则是各种慢性肾脏病(Chronic kindey disease,CKD)的共同最终通路。在肾脏纤维化的过程中,上皮-间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)是肾脏产生大量纤维细胞和肌成纤维细胞及基质沉积的重要途径。LN过程中大量自身抗体及免疫复合物的形成可造成肾脏的氧化应激损伤,产生大量的活性氧(Reactive oxygen species,ROS),可诱导肾小管间质发生EMT进而促进肾脏纤维化。NADPH氧化酶(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH Oxidase)系统是ROS的主要来源,其中Nox4是肾小管上皮细胞表达的主要类型,但Nox4来源的ROS是否参与肾小管上皮细胞发生EMT尚未可知。研究发现,在肺泡上皮细胞中,E3泛素连接酶Cbl-c可启动泛素-蛋白酶体系统(Ubiquitin-proteasome system,UPS)促进Nox4的降解延缓肺的纤维化,但目前Cbl-c在肾脏是否能发挥类似作用尚无相关研究。本研究旨在探讨Nox4型NADPH氧化酶在狼疮性肾炎肾脏纤维化中的作用以及泛素化降解Nox4的干预作用。探讨Nox4型NADPH氧化酶在狼疮性肾炎(LN)肾小管上皮细胞上皮-间质转分化中的作用及其干预研究,为狼疮性肾炎肾间质纤维化的机制研究和临床治疗提供新的思路。方法1.收集2014年1月-2015年8月河南省人民医院肾内科收治并行肾活检病理检查确诊为LN的患者31例,取其肾穿刺组织作为实验组,另取3例肾脏肿瘤患者的瘤旁组织作为正常对照组,应用免疫荧光法检测所有肾脏组织标本中肾小管间质内Nox4型NADPH氧化酶(Nox4)、平滑肌肌动蛋白(ɑ-SMA)、纤维连接蛋白(FN)的表达情况并进行半定量分析。2.以抗ds-DNA抗体刺激人肾小管上皮细胞(HK-2)模拟狼疮性肾炎(LN)的过程,将常规培养的人肾小管上皮细胞分为以下4组:(1)正常对照组(10%FBS的DMEM-F12培养基),(2)抗体组(10%FBS的DMEM-F12培养基+100ug/ml抗ds-DNA抗体),(3)空转组(10%FBS的DMEM-F12培养基+Cbl-c cDNA转染),(4)转染+抗体组(10%FBS的DMEM-F12培养基+Cbl-c cDNA转染+100ug/ml抗ds-DNA抗体)。给药72h后,对以上各组细胞进行以下检测:(1)釆用MTT法检测细胞的增殖情况;(2)酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞上清液的转化生长因子(TGF-β1)水平;(3)釆用DCFH-DA荧光探针法检测各组细胞的活性氧(ROS)水平;(4)釆用Western印迹法检测各组细胞的Nox4蛋白、钙粘附蛋白(E-cadherin)、ɑ-SMA蛋白、FN蛋白的表达水平。结果1.肾脏组织免疫荧光结果显示,LN患者肾脏组织的小管上皮处有微弱表达的Nox4,在肾小球系膜区和肾小管间质内可见大量α-SMA、FN的表达,且其表达量与LN的病理类型相关,病理类型为Ⅱ型的表达量相对较少,Ⅳ型相对较多;而正常对照组中,均无相应目的蛋白的表达。2.1.抗ds-DNA抗体培养一定时间后,HK-2细胞的增殖活力降低,镜下察到细胞形态由多边形变化为梭形,细胞间隙增大;而转染+抗体组中HK-2细胞的增殖活力较抗体组有所增加。抗ds-DNA抗体还能诱导肾小管上皮细胞产生大量TGF-β1,而转染+抗体组中的TGF-β1较抗体组无明显改变,提示狼疮性肾炎目的中可产生大量促纤维化因子TGF-β1,而过表达Cbl-c对TGF-β1的分泌无特殊作用。2.2.抗ds-DNA抗体培养一定时间后,HK-2细胞的Nox4蛋白水平较对照组明显上调,ROS水平显著增高,提示狼疮性肾炎中Nox4型NADPH氧化酶的表达上调可促进ROS的生成。Cbl-c转染可显著降低Nox4的表达;与抗体组相比,转染+抗体组中HK-2细胞的Nox4蛋白水平和ROS的生成均明显降低,提示促进Nox4型NADPH氧化酶的降解可有效减少ROS的产生。2.3.与对照组相比,抗体组中肾小管上皮细胞的间质细胞标志物ɑ-SMA蛋白、FN蛋白水平显著增高,上皮细胞标志物E-Cadherin蛋白水平明显降低;而与抗体组相比,转染+抗体组中的ɑ-SMA蛋白、FN蛋白水平明显降低,E-Cadherin蛋白水平有所增高。这提示狼疮性肾炎中的肾小管上皮细胞可发生上皮-间质转分化(EMT),且与Nox4型NADPH氧化酶的活化密切相关,而促进Nox4的降解可显著抑制EMT的发生。结论1.狼疮性肾炎中Nox4型NADPH氧化酶/ROS氧化应激通路的激活,可促使肾小管上皮细胞发生上皮-间质转分化,导致肾脏纤维化的发生。2.泛素化降解Nox4型NADPH氧化酶可有效抑制ROS的产生和肾小管上皮细胞的上皮-间质转分化,延缓肾间质纤维化的进程。