DNA作为生命体主要的遗传因子,在携带和传递上遗传信息的起着至关重要的作用。然而各种非生物和生物的胁迫,如紫外、电离辐射、化学诱变剂、自由基、细菌病毒等都会导致DNA发生损伤,从而会引起DNA的物理和化学性质发生改变,进而产生细胞和遗传毒害作用。这些损伤主要包括DNA碱基修饰、DNA单链断裂、DNA铰链、DNA双链断裂等。由于植物本身营固着的生活方式以及储蓄能量而对于阳光的依赖性,使得在其维护基因组的完整性上更是面临巨大的挑战,为了确保其基因组物理结构的完整性和化学性质稳定性,植物已经进化出了高效广泛的DNA损伤的检测和修复机制。在各种因素诱导的DNA损伤中,DNA双链断裂(DNA double-strand breaks,DSBs)是目前已知的最具毒性的损伤形式。生物体主要通过非同源末端连接修复通路(NHEJ)和同源重组修复通路(HR)两种方式对其进行修复。盐穗木(Halostachys caspica)属苋科多年生灌木,是新疆荒漠地区典型的耐盐植物。以其独特的环境适应能力成为研究耐盐机制的理想材料。本课题组前期对盐胁迫下盐穗木转录组进行测序分析,发现了一类与DNA损伤修复相关的且明显上调的unigene,本研究从这些DNA损伤修复相关的unigene中挑选了2个与DSBs修复相关的基因:HcDNA聚合酶(HcDNApolλ)和减数分裂特异性重组蛋白(HcDMC1),其中DNApolλ通过非同源末端链接途径参与DSBs的修复,而DMC1参与同源重组修复途径对DSBs进行修复。利用RECA克隆其基因全长,通过原核和真核酵母系统分析它们的盐胁迫下耐受性的,以研究它们在DSBs修复中的作用,为深入研究盐穗木耐盐机制奠定基础。本研究的主要结果如下:1.基于盐胁迫下盐穗木转录组测序的EST序列,利用RACE技术克隆获得了盐穗木DNA损伤修复基因HcDNA聚合酶λ(HcDNApolλ)基因,开放阅读框1,335 bp,编码444个氨基酸,生物信息学预测该基因编码的蛋白定位于细胞核。保守结构域分析显示,盐穗木HcDN polλ基因属于DNApolX家族成员,系统进化分析显示盐穗木HcDNA polλ为独立的分支。实时荧光定量qRT-PCR分析表明,随着在胁迫浓度的增加,HcDNApolλ的表达逐渐增强且在14d时达到峰值表明Hc DNApolλ基因的表达受盐胁迫的诱导。为了进一步研究盐穗木HcDNApolλ的盐胁迫的耐受性,我们究构建了含有盐穗木HcDNApolλ的原核表达载体pET30a-HcDNApolλ,通过检测添加不同浓度NaCl胁迫下重组菌的生长曲线,表明HcDNApolλ可以增强重组大肠杆菌的盐胁迫耐受性。构建了植物表达载体pCAMBIA-HcDNApolλ,转化农杆菌并浸染拟南芥,并纯化了His-HcDNApolλ蛋白,制备获得了滴度约为1:200000的抗HcDNApolλ的多克隆抗体,为以后检测HcDNApolλ蛋白奠定了基础。为在植物中验证HcDNApolλ的功能奠定了基础。2.根据前期克隆获得的盐穗木HcDMC1基因,以及盐胁迫下的表达规律,表明HcDMC1受盐胁迫诱导。为了深入研究盐穗木HcDMC1的耐盐性,本研究构建了原核表达载体pET30a-HcDMC1,检测了不同浓度NaCl胁迫下重组大肠杆菌的生长曲线。进一步纯化了HcDMC1蛋白,制备获得了滴度约为1:400000的抗HcDMC1的小鼠抗血清,为以后检测HcDMC1蛋白奠定了基础。进一步构建了酵母表达载体pYES2-HcDMC1,检测了不同浓度NaCl胁迫下重组酵母的生长状况。结果表明HcDMC1可以增加重组大肠杆菌和重组酵母的盐胁迫耐受性。构建了植物表达载体pCAMBIAHcDMC1,转化农杆菌并浸染拟南芥,为在植物中验证HcDMC1的功能奠定了基础。以上结果显示,盐穗木HcDNApolλ和HcDMC1参与了植物对盐胁迫的响应,能够提高胁迫下重组菌的生长。