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背景:脑卒中是严重威胁着人类的生命健康的重大疾病之一。Nurr1是核受体4家族的一个成员。Nurr1在炎症反应中明显下调且参与帕金森疾病中神经元的死亡。microRNAs在脑缺血再灌注损伤中发挥重要作用参与多种关键因子的转录水平的调节。Nurr1的异常表达与多种信号通路相关有,但miRNA与Nurr1的调节关系在脑缺血再灌注损伤中几乎未见报道。目的:本研究目的在于:(1)在体内和体外实验探索Nurr1在脑缺血再灌注损伤中的表达情况及Nurr1相关的microRNAs;(2)在体内和体外实验探索Nurr1蛋白的转录后调控网络,及其在活化的胶质细胞的具体作用机制;(3)探究miR-145-5p/Nurr1/TNF-a轴信号在大鼠脑缺血再灌注损伤中的具体功能。方法:(1)原代神经元细胞和小胶质细胞培养。(2)神经元细胞与小胶质细胞共培养模型建立及OGD/R实验。(3)大鼠大脑中动脉梗塞再灌注(MCAO/R)模型构建,神经功能学结果与梗塞体积分析。(4)RNA提取,逆转录和实时定量qPCR。(5)大鼠侧脑室注射miR-145-5p mimic和miR-145-5p antagomir。(6)Nurr1 3’UTR克隆与双荧光素酶报告分析。(7)MTS方法检测细胞活力。(8)染色质免疫共沉淀。(9)蛋白质免疫印迹与免疫荧光染色。结果:(1)构建大鼠MCAO模型,栓塞其左侧大脑中动脉1.5h后,再灌注2h、6h、12h、24h、48h五个时间点,取大脑皮层和海马进行Western Blot、免疫荧光检测。结果显示:在假手术sham组中,大鼠脑皮质和海马组织中Nurr1蛋白和mRNA表达水平较高,再灌注2h时,Nurr1蛋白和mRNA表达水平较正常组开始明显下降。再灌注12h时,Nurr1蛋白和mRNA表达水平下降至最低点。再灌注24h时,Nurr1蛋白和mRNA表达水平开始回升至48h。(2)选取构建大鼠MCAO模型再灌注6h、12h、24h、48h四个时间点,剔除小脑和脑干组织提取总RNA来做microRNA芯片检测。结果显示大约11个miRNAs在再灌注24h时表达情况有差异。具体有:miR-145-5p、miR-34c-5p、miR-365-3p、miR-214-3p、miR-151、miR-27a、miR-153-5p、miR-365-3p、miR-33-5p、miR-217-5p和miR-129-5p。生物信息学结果预测到miR-145-5p、miR-365-3p、miR-34c-3p和miR-217-5p与Nurr1的3’UTR结合的种子区域,且成功构建了Nurr1的3’UTR突变位点。结果显示miR-145-5p可靶向抑制Nurr1的表达。(3)将小胶质细胞进行OGD/R试验,选取再灌注不同时间点0.5h、1.0h、2.0h、6h和12h六个时间点来筛选miR-145-5p表达变化。miR-145-5p表达从OGD/R试验开始便持续增长,OGD/R 2.0h达到高峰,随后便开始下降,直至OGD/R 12h。然而,在原代神经元细胞内并未见到miR-145-5p表达出现明显变化。小胶质细胞中Nurr1 mRNA表达水平从OGD/R试验开始便一直下降,且在OGD/R 2.0h出现高峰。miR-145-5p可抑制小胶质细胞中内源性Nurr1的表达。在OGD/R条件下,miR-145-5p表达下调可明显引起神经元细胞活力增强,且可能通过作用于Nurr1、TNF-a等分子实现。(4)将小胶质细胞进行OGD/R试验,选取再灌注不同时间点0.5h、1.0h、2.0h、6h和12h六个时间点来筛选TNF-a的表达变化。qRT-PCR实验结果显示:TNF-a mRNA表达从OGD/R试验开始便持续增长,OGD/R 2.0h达到高峰,随后便开始轻微下降。在小胶质细胞OGD/R2.0h试验后,基因转染结果显示:Nurr1 plasmid转染组的Nurr1高表达能明显抑制TNF-a mRNA和蛋白水平的表达。相反,Nurr1-siRNA处理组TNF-a mRNA和蛋白水平的表达水平明显上调。染色质免疫共沉淀实验结果显示:Nurr1 plasmid转染组的Nurr1可以明显结合TNF-a基因启动子,在小胶质细胞OGD/R 2.0h试验后,Nurr1与TNF-a基因启动子结合律变高。(5)在大鼠侧脑室注射miR-145-5p mimic和anti-miR-145-5p以验证miR-145-5p对大鼠脑缺血再灌注损伤的作用。进一步比较了MCAO/R手术12 h和24 h后的平均梗死体积。结果发现MCAO/R 12 h后,antimiR-145-5p处理组的梗死体积可减少24.05%,而miR-145-5p mimic组的梗死体积可增加11.05%。qRT-PCR实验结果显示:MCAO/R 12 h组,注射anti-miR-145-5p可明显上调Nurr1 mRNA表达、下调TNF-a mRNA表达。MCAO/R 12 h脑组织冰冻切片的免疫荧光结果显示,anti-miR-145-5p注射组小胶质细胞内Nurr1表达明显强于miR-145-5p mimic组。(6)在MCAO/R手术7天与14天后用mNSS和错步实验来分别检验anti-miR-145-5p、miR-145-5p mimic处理后大鼠脑缺血再灌注损伤后神经功能学的恢复情况。结果显示:anti-miR-145-5p处理后的大鼠mNSS评分和错步率明显低于miR-145-5p mimic组。miR-145-5p抑制有利于大鼠脑缺血再灌注损伤后神经功能学的恢复。结论:大脑缺血再灌注损伤中miR-145-5p高表达可明显抑制Nurr1蛋白表达,进而减退小胶质细胞中Nurr1对TNF-a的转录抑制作用。此信号通路最终引起TNF-a相关的神经元损伤效应。侧脑室注射anti-miR-145-5p可明显减少缺血再灌注损伤导致的脑组织梗死体积。阻滞miR-145-5p-Nurr1-TNF-a信号轴的异常激活可明显改善脑缺血再灌注损伤的预后。然而,miR-145-5p/Nurr1/TNF-a轴信号中的TNF-a下游的功能与机制尚不明确,还需更多的实验来证实。