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缺血性脑血管病是因脑部供血障碍所引起的脑组织相应区域缺血及缺氧而造成脑组织的破坏,从而出现一系列生化代谢异常、生理功能丧失的疾病,是世界范围内死亡和长期残疾的主要原因。脑缺血的有效治疗主要涉及机体适应缺氧/缺血、血管新生及神经元的保护/再生等方面。低氧诱导因子(hypoxia-inducible factors, HIF)是细胞在基因转录水平协调氧变化的最主要的调节因子,是一种介导细胞内低氧反应的核转录复合体,促进其激活有利于缺血性疾病的治疗。通过HIF-1α上调血管内皮生长因子(VEGF)的表达可在脑和心脏中诱导目标区域形成新的血管,从而增加血流量和氧供应并减轻缺血的不良反应。血管内皮生长因子(ascular endothelial growth factor, VEGF),是内皮细胞(Endothelial cells,ECs)特异性促有丝分裂原,也是作用最强,特异性最高的促血管生长因子。发生脑缺血后,VEGF是血管生成、神经保护和神经再生过程中最重要的生长因子。它能够显著提高缺血脑部的血管生成,并减少恢复过程中的神经功能损伤。神经生长因子(Nerve growth factor, NGF),是神经营养因子家族的典型成员,具有神经元营养和促突触生长双重生物学功能,对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用。NGF除了神经保护以外还可通过促进血管再生改善缺血性疾病。因此以HIF1α, VEGF和NGF为靶点筛选脑缺血治疗药物,不仅有助于抗脑缺血药物的开发,也为药物抗脑缺血作用机制研究提供一定的前期基础。本研究构建了以HIF1α, VEGF, NGF启动子为作用靶点的细胞筛选模型,可用于高效、分类筛选具有抗脑缺血功效的药物成分。首先,用HIF1α, VEGF和NGF基因的启动子序列(其中,HIF1α选取了两个序列)分别调控报告分子红色荧光蛋白(E2-Crimson,E2)或荧光素酶(Luciferase, Luc)基因的转录,以此构建了8个重组质粒：pHp1-E2, pHp2-E2, pVp-E2, pNp-E2; pHp1-Luc, pHp2-Luc, pVp-Luc, pNp-Luc,其中,Hp, Vp和Np分别表示HIF1α promoter,VEGF promoter和NGF promoter。随后,用这8个质粒分别转染HEK293细胞,建立了24株稳定的单克隆细胞株(每个质粒建立3株细胞),分别命名为293-pHp1-E2a,b,c,293-pHp2-E2a,b,c,293-pVp-E2a,b,c,293-pNp-E2a,b,c;293-pHp1-Luca,b,c,293-pHp2-Luca,b,c,293-pVp-Luca,b,c和293-pNp-Luca,b,c。再利用二氯化钴、脂多糖、盐酸克伦特罗等阳性刺激物分别对含HIF1α, VEGF, NGF启动子序列的3类细胞株进行功能验证,建立以HIF1α,VEGF,NGF启动子为作用靶点的3类药物筛选的细胞模型：293-pHp1-Luc,293-pHp2-Luc,293-pVp-Luc和293-pNp-Luc。最后,应用鉴定出的细胞模型对25种中药单体进行了筛选,初筛获得6个对VEGF基因转录有激活作用的中药单体。本研究建立的细胞筛选模型不仅可对药物进行快速筛选而且可同时进行大致功能分类,并对其效果进行定量判断。这为寻找新型抗脑缺血药物及其先导化合物提供了有力工具,也有助于中药抗脑缺血作用机制的发现及其基因转录调控机制的探索。