本文利用基因克隆技术探究了松材线虫携带的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)GcM5-1A是否含有溶血素基因以及溶血素活性。根据荧光假单胞菌疑似溶血素的基因序列设计一对引物,通过PCR技术扩增得到疑似溶血素基因Hly。将该基因克隆到表达载体pET-15b上,构建了pET-15b-Hly。重组质粒pET-15b-Hly转化E.coli BL21(DE3)构建工程菌株,工程菌经过异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,SDS-PAGE分析表明,工程菌全蛋白比未转化重组表达载体的E.coli BL21(DE3)多出一条带,条带约在26 kDa大小左右,这与序列分析时所预测的荧光假单胞菌溶血素大小相吻合,疑似溶血素在大肠杆菌中得到了表达。利用Ni-Sepharose 6(FF)亲和树脂纯化了重组蛋白,溶血实验显示,纯化的重组蛋白可使鸡红细胞发生溶血,证实本研究所克隆基因确实编码溶血素。溶血素大致可分三类:酶类、成孔类、表面活性剂类,为探究荧光假单胞菌重组溶血素溶血机制,本文进行了渗透保护实验、金属离子及酶抑制剂对溶血素溶血效应影响实验及100℃高温处理实验。实验结果显示,金属离子及酶抑制剂没能促进或抑制荧光假单胞菌重组溶血素的溶血活性,高温处理后溶血素失去溶血活性,聚乙二醇能够抑制溶血素活性,这说明,重组溶血素为成孔类毒素。重组溶血素对黑松切根苗毒性实验显示,无菌水处理切根幼苗长势良好,无萎蔫现象,溶血素处理的黑松幼苗死亡率随溶血素浓度增大而也逐渐升高。处理4 d后,20μg/mL溶血素就表现出对黑松幼苗的毒性,当溶血素浓度为100μg/mL时,黑松幼苗的死亡率达到100%。4℃条件下用浓度为60μg/mL溶血素处理黑松愈伤组织细胞4 d,愈伤组织存活率比未用溶血素处理的愈伤组织细胞存活率下降了21.41%,27℃条件下浓度60μg/mL溶血素处理黑松愈伤组织细胞24h内可致黑松愈伤组织细胞死亡。本文实验结果证明,松材线虫携带荧光假单胞菌GcM5-1A可合成溶血素,重组溶血素对黑松幼苗及愈伤组织细胞均有致死活性,这为深入研究松材线虫携带细菌在松材线虫病病理进程中的作用打下了基础。