研究背景:血栓形成及栓塞是大量心脑血管疾病的病理基础。目前,经静脉给予tPA等药物溶栓是这类疾病主流的治疗方法。经静脉溶栓有严格的时间窗,安全性和有效性也还有较大的提高空间。经导管介入治疗是当前临床血栓性疾病的另一类治疗方法。最近几年,随着更有效的新型介入取栓导管的使用,研究表明,机械取栓联合全身或局部注射溶栓药可以提高梗阻血管的早期再通率、改善预后,因此,经导管介入治疗逐渐获得了临床越来越多的认可。超声溶栓技术是溶栓治疗的一个重要发展方向。尽管超声溶栓的机制目前仍未得到彻底阐明,但一般认为其中一个重要的机制是超声激励体内生成的微气泡或者经静脉注射的微泡产生的空化效应。微泡的参与在超声增强溶栓的过程中起了十分重要的作用,但是由于生物体自身一般缺乏超声空化需要的空化核微泡,因此,在超声溶栓过程中引入外源性微泡是非常必要和有利的选择。经体表超声辅助溶栓研究和应用存在的一个重要的问题是临床上大多数血栓都是梗阻性的,经外周静脉注射的微泡无法输送到血栓局部,造成血栓的“空化靶向性”较差。课题组前期研究发现,采用直接血栓内注射微泡联合体外超声辐照增强尿激酶溶栓方法产生的溶栓效果,显著优于常规经外周循环液注射微泡增强的超声溶栓方法,也优于单纯血栓内注射尿激酶的溶栓效果。血栓内注射微泡则可以通过血管内导管介入方法实现。经体表超声溶栓存在的另一个问题是大量需要溶栓治疗的血栓缺乏合适的体外超声辐照声窗。采用血管腔内超声导管溶栓的方法是目前已开始在临床应用的溶栓方法。在欧美,EKOS公司的EkoSonic?血管内超声溶栓导管已获批准用于临床急性肺动脉栓塞和下肢深静脉血栓等的溶栓治疗。但这种超声溶栓导管由于超声能量较高,仍可能产生血管壁损伤的副作用,因此需要实时测温和水冷循环系统降温,这就导致导管设计工艺复杂,价格昂贵。本课题拟在动物实验验证血栓内输注微泡增强超声溶栓有效性及可行性基础上,设计制作一种基于微泡空化的血管腔内超声溶栓导管,综合血栓内微泡超声溶栓和血管内超声导管声窗理想的优点,有望产生更为有效、迅速的溶栓效果。研究目的:1.证实超声联合血栓内持续输注微泡溶液,可以显著提高经导管介入药物溶栓效果;2.设计制作基于微泡空化的新型血管内超声溶栓导管,并证实其可以在持续输注微泡溶液的配合下,在体外梗阻性血栓模型中有效增强rt-PA介入溶栓效果。材料与方法:1.主要实验仪器:⑴改进的彩色多普勒超声诊断仪——VINNO 70(飞依诺科技有限公司,苏州,中国),配备X4-12L线阵探头。为溶栓实验增加的Vflash治疗脉冲发射程序,主要的改进为在其常规的极低机械指数(MI=0.04)造影成像软件的基础上叠加一个可调节治疗窗,治疗窗内治疗脉冲受控间断发射。本研究中设定,在每一个治疗帧频时间内,中心频率为2.5 MHz、脉冲宽度为5μsec的治疗脉冲逐线发射;治疗窗中发射的治疗脉冲线密度约为32/cm,调整治疗窗大小,以完整覆盖整个血栓栓塞血管节段。设定治疗脉冲发射重复频率为50 Hz,脉冲作用时间及间歇时间分别设定为0.5 sec和2.0 sec,MI约为0.50。在水槽微泡空化预实验中证实,以上设置可以有效击破治疗窗中的大部分微泡,而治疗窗两侧的微泡基本无明显破坏。⑵微量匀速注射泵:Longerpump?TJP-3A,保定兰格恒流泵有限公司生产。⑶多功能酶标仪:型号Varioskan Flash 3001-1723,由美国Thermo Fisher科技公司生产。⑷超声换能器阻抗分析系统:Agilent E4991A,美国Agilent科技有限公司生产。⑸任意信号发生器:Hantek HDG 2022B,青岛汉泰电子有限公司生产。⑹针式水听器:ONDA HNC-0100,美国ONDA公司生产,传感器直径为0.1 mm。⑺3D声场扫描系统:英国Precision Acoustics有限公司生产。⑻声场仿真软件:COMSOL Multiphysics 4.3a多物理场仿真系统,瑞典COMSOL公司开发。⑼激光共聚焦显微镜:莱卡TCS SP5,德国Leica显微系统有限公司生产。2.主要实验试剂:⑴微泡:本实验室自制的包裹全氟丙烷核心气体的脂膜微泡“脂氟显”,微泡平均粒径约为1.95±0.52μm,浓度约为2.0-9.0×109/ml,根据实验需要稀释使用。⑵溶栓药物:注射用重组组织型纤维蛋白溶酶原激活剂(rt-PA),德国Boehringer Ingelheim药业有限公司生产。⑶兔D二聚体酶联免疫检测试剂盒:美国休斯敦Cloud-Clone公司生产。⑷抗凝牛全血:郑州市九龙生物制品有限公司生产,由健康牛全血添加血液保存液抗凝处理制成,4℃保存。⑸抗凝牛新鲜冰冻血浆:郑州市九龙生物制品有限公司生产,由新鲜抗凝牛全血在取血后6 h内经4℃低速离心取得的血浆,于-30℃以下迅速冰冻制得。试剂存储于-20℃冰箱,使用前于37℃水浴中快速复温。⑹兔抗牛纤维蛋白原抗体:购自北京博奥森生物技术有限公司。⑺羊抗兔Ig G:购自北京中杉金桥生物技术有限公司。抗体使用前先用异硫氰酸荧光素(FITC)进行标记。3.实验动物:健康新西兰大白兔40只,均为雄性,体质量为2.5-3.0 kg,由第三军医大学实验动物中心提供并完成检疫。4.实验方法:⑴改进的诊断超声联合血栓内输注微泡提高经导管介入药物溶栓动物实验:(1)建立实验兔急性梗阻性下腔静脉血栓模型:模拟“Virchow三部曲”的过程,主要步骤包括血管内皮损伤(目标血管局部止血钳钳夹损伤)、血流状态改变(目标血管节段近端使用血管夹夹闭)和血液凝固状态改变(目标血管局部管腔内注入凝血酶)。(2)随机对照实验:40只实验兔按随机分组顺序,分别接受以下四组治疗,每组10只:超声Vflash联合微泡增强经导管rt-PA溶栓(CDT+UT)组、超声Vflash联合微泡溶栓(UT)组、单纯经导管rt-PA溶栓(CDT)组、生理盐水对照(Control)组。(3)有效性评价指标:基于二维超声及超声造影所见的梗阻性血栓溶栓效果评分(治疗开始30 min及60 min);ELISA法检测各组实验兔溶栓前后血浆D二聚体水平;实验段下腔静脉血栓病理检查。(4)安全性观察:兔近心段下腔静脉、右心系统、肺动脉及分支血栓形成及继发性栓塞发生情况。⑵新型血管内超声溶栓导管探头的设计及声学检测:(1)选取微型超声换能器并通过阻抗测试筛选合适的激发频率。(2)制备单换能器超声探头,并对其进行适宜频率激发下的声场扫描、电-声转换测试。(3)利用COMSOL Multiphysics仿真系统对溶栓导管单换能器、换能器组、多组换能器组合声场进行仿真,并优化其组合方案。(4)采用被动空化检测方法检测超声溶栓导管探头微泡空化能力,并通过对散射信号半定量分析方法确定使介质中微泡发生稳态空化及瞬态空化的适合激励电压,为下一步实验筛选合适参数。⑶基于微泡空化的血管内超声增强tPA体外溶栓实验:(1)制备牛全血血栓:洁净2.0 ml EP管中加入5%氯化钙溶液33μL(相当于氯化钙1.11 mg),加入1.0 ml牛全血样品,混匀后静置于37℃恒温水箱中水浴3小时,制备牛全血血栓。(2)构建梗阻性血栓体外溶栓实验系统。(3)随机对照实验:实验共设以下5组(n=10),分别为血栓内超声联合微泡增强t PA溶栓组(US+MB+TPA)、血栓内超声增强tPA溶栓组(US+NS+TPA)、血栓内超声联合微泡溶栓组(US+MB)、单纯血栓内注射tPA溶栓组(TPA alone)及血栓内注射生理盐水对照组(Control)。(4)有效性评价指标:各组溶栓率。(5)溶栓机制探讨:残余血栓石蜡包埋切片HE染色光镜观察;纤维蛋白免疫荧光染色激光共聚焦显微镜观察。结果:1.改进的诊断超声联合血栓内输注微泡提高经导管介入药物溶栓动物实验:⑴所有实验兔均建模成功并完成整个溶栓实验。实验结束后对摘取的实验兔近心段下腔静脉、心脏及肺动脉进行检查,均未发现有局部血栓形成及继发血栓栓塞;⑵治疗开始30 min时,CDT+UT组溶栓效果评分显著高于其他各组(P<0.05),单纯CDT组、单纯UT组及对照组溶栓效果评分差异无统计学意义(P>0.05);治疗开始60 min时,CDT+UT组及单纯CDT组溶栓效果评分均显著高于UT组及对照组(P<0.05);⑶CDT+UT组治疗后兔血浆D二聚体浓度显著升高(P<0.05),而其他各组实验兔血浆D二聚体水平变化均无统计学意义;⑷病理检查见CDT+UT组实验段下腔静脉血栓几乎全部或大部分溶解,仅残存小片状血栓附着于受损伤较明显的IVC血管壁上;单纯UT组及单纯CDT组实验段下腔静脉血栓中部可见不同程度部分溶解,因固定、制片过程中血栓退缩,血栓边缘部分与血管壁脱离,形成不规则腔隙;对照组血栓中部见小片状溶解,血栓边缘与血管壁之间亦可见因血栓退缩形成小片不规则腔隙。2.新型血管内超声溶栓导管探头的设计及声学检测:⑴阻抗测试显示1.5 MHz为选取的微型超声换能器的次最佳谐振频率。单个微型换能器声场分布可以表征为点声源,其声压随与换能器表面距离增大迅速降低。在测量范围内峰值声压与换能器外加交变电压(15-52.5 V)呈良好的线性相关,具有良好的电—声转换效率。⑵声场仿真结果显示,双换能器背靠背组合成换能器组,可形成绕换能器组一周的较均匀声场;两组、多组换能器组沿导管方向并联组合后,沿导管长轴方向可形成叠加声场;当换能器组间距为5.0 mm及以下时,沿导管长轴方向可形成较均匀的声场。⑶被动空化检测及散射信号半定量分析显示,当换能器声压为0.25 MPa时,仅检测到较小幅值的微泡谐振信号;换能器声压为0.50 MPa时,超谐波信号幅度超过噪声至少3d B,为稳态空化为主;换能器声压为0.75 MPa及以上时,特定噪声分量幅值上升达二次谐波信号10dB以内,提示为瞬态空化为主。3.基于微泡空化的血管内超声增强tPA体外溶栓实验:⑴血栓内超声联合微泡增强t PA溶栓组(US+MB+TPA)溶栓率显著高于其他各组(P<0.05);US+NS+TPA组、TPA alone组溶栓率也显著高于血栓内注射生理盐水(Control)对照组(P<0.05);但US+MB组与血栓内注射生理盐水对照组溶栓率差异无统计学意义(P=0.142)。⑵残余血栓HE染色显示,除血栓内注射生理盐水对照组外,其余各组均可见血栓残体内部范围、程度不一的疏松改变,以US+MB+TPA组为著;纤维蛋白免疫荧光染色显示对照组血栓内密集交联的纤维蛋白网以及网罗于血栓纤维蛋白网中间的细胞成分,血栓中部导管插入部位附近由于血块收缩,纤维蛋白条索较血栓内部增粗、密集;使用tPA的各组血栓纤维蛋白网结构均可见不同程度松解、断裂,以接近血栓中部导管插入部位为著。结论:1.诊断超声仪发射的经过适当改进的中等MI、较长脉冲超声联合血栓内微泡,可以显著提高经导管介入的药物溶栓效果。这种综合溶栓治疗方法有望加速血栓清除、进一步降低溶栓药使用总量,从而降低溶栓相关并发症发生的风险。2.基于微泡空化的新型血管内超声溶栓导管,综合利用了血栓内微泡增强的超声溶栓作用和血管内超声直接接触作用于血栓的优点,可以有效增强rt-PA的溶栓作用。3.超声联合血栓内微泡增强药物溶栓的机制为空化效应促进溶栓药物对血栓的渗透、加速其纤溶进程,并促进纤维蛋白降解产物向周围的弥散。