【摘 要】
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Heparosan作为E. coli K5荚膜多糖的主要组成部分,可以作为肝素生产的前体。本研究以提高heparosan产量为目的,对kfiA、kfiC进行表达研究,同时表达、纯化了肝素酶Ⅱ (Heparin
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Heparosan作为E. coli K5荚膜多糖的主要组成部分,可以作为肝素生产的前体。本研究以提高heparosan产量为目的,对kfiA、kfiC进行表达研究,同时表达、纯化了肝素酶Ⅱ (HeparinaseⅡ)并将其用于E.ccoli K5荚膜原位处理以提高菌株质粒转化率。利用PCR技术,以E. coli K5基因组DNA为模板,成功克隆了kfiA基因片段,并连接至pMD19-T载体,构建了pMD19-kfiA克隆载体。经PCR验证和测序比对,克隆片段100%符合目标条带。构建了表达载体pET28b-kfiA,转化至E. coli BL21(DE3),获得了重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-kfiA。经过IPTG诱导,成功表达了KfiA蛋白,经过变性条件His-tag亲和层析得到了KfiA蛋白,UN-Scan-it gel6.1分析蛋白分子量,大小约为29.12kDa。IPTG的最佳诱导浓度为0.8mmol/L,随着诱导时间的增加,蛋白表达量增加,4小时为较佳诱导时间。同时将kfiC基因连接至pET28b-kfiA,构建共表达载体pET28b-kfiA-C,并转化至E. coli BL21(DE3)获得重组菌E. coli BL21(DE3)/pET28b-kfiA-C。经过PCR验证、双酶切验证和测序比对,片段符合目标条带。经过IPTG诱导,重组菌E. coli BL21(DE3)/pET28b-kfiA-C成功表达出了KfiA蛋白,但未见明显的KfiC蛋白表达条带。自诱导培养基可以诱导E. coli BL21(DE3)/pET15b-hepB表达可溶性Heparinase Ⅱ蛋白,经过His-Tag亲和层析,纯度可达96%,经酶活分析,酶活为200U/mL,比活力为139U/mg。Ni-NTA亲和层析纯化收率为41.90%。收获的Heparinase Ⅱ蛋白能够降解Heparosan;用其对E. coli K5荚膜多糖进行原位处理后,可以提高热激转化后转化子得率,并成功获得重组菌E. coli K5/pET28b-kfiA和E. coli K5/pET28b-kfiA-C,但是IPTG诱导未得到明显目标条带；TEM观察显示Heparinase Ⅱ对菌体荚膜有一定的处理效果。
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