论文部分内容阅读
洛伐他汀(lovastatin)及其半合成的衍生物是常用的降血脂药物。在工业规模上,洛伐他汀主要由土曲霉(Aspergillus terreus)发酵生产。Cre A是真菌中常见的分解代谢物阻遏因子,其主要功能是使阻遏某些酶以及次级代谢产物的合成。为进一步提高土曲霉的洛伐他汀产量,降低Cre A对洛伐他汀生物合成的影响,本工作在土曲霉中成功建立了si RNA干扰体系。通过RNAi技术,进行了一系列Cre A对洛伐他汀合成影响的研究。本工作首先在土曲霉(A.terreus ATCC20542)中建立了有效的基因表达系统。p UC19上以土曲霉的组成型表达基因pdc的启动子、终止子构建了土曲霉的表达盒Ppdc-Tpdc。在Ppdc-Tpdc上插入了红色荧光蛋白基因Ds Red,通过对土曲霉的转化将表达盒p UCACE-Ds Red整合至土曲霉的基因组中。经过重组菌株的培养观察,可清晰观察到单个菌丝体的形态且红色荧光分布于整个菌丝体上,转化子可稳定表达红色荧光。说明表达载体p UC-ACE-Ds Red可用于土曲霉细胞内基因的表达。然后将土曲霉的creA基因的干扰片段插入p UC-ACE中,构建creA基因的干扰表达载体并将其转化至土曲霉中,将Ppdc-si RNA-Tpdc整合至土曲霉基因组中,得到重组菌株A.terreus-i Cre A。重组菌株洛伐他汀发酵培养基培养,检测起基因表达水平及洛伐他汀产量的变化。通过实时荧光定量PCR发现creA基因在发酵的过程中随着时间延长逐渐下降,通过高效液相色谱发现洛伐他汀的产量逐渐提高,且creA基因的表达量相对于未经RNA干扰的对照组显著降低、洛伐他汀的产量相对于未经RNA干扰的对照组别有显著性的提高,发酵7天后creA基因相对表达量下调了63%、洛伐他汀含量提高了22.59%。本工作成功建立了在土曲霉中通过RNAi是基因表达下调的方法,证明了creA基因转录表达对土曲霉产洛伐他汀的抑制作用,并提出了通过使表达下调提高洛伐他汀合成效率的新思路。