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选题依据:远志是我国重要的大宗药材,同时也是山西的道地药材。作为远志的主要活性成分之一,远志皂苷具有抗痴呆、改善记忆障碍及脑保护等药理作用。但是,由于远志皂苷属于齐墩果烷型五环三萜皂苷,其糖苷配基种类多样、结构复杂,具有多个手性中心,导致从单个糖苷配基衍生出的皂苷结构更加复杂繁多,仅从原远志皂苷元衍生而出的皂苷就有50余种。从远志药材中直接提取远志皂苷,面临着有效成分含量低、药材资源有限、难以纯化等诸多弊端;而通过全化学途径合成,由于涉及多步纯化,步骤繁琐,难以保证较高产率;若通过植物组织培养的方式获得远志皂苷,又面临着操作周期长且复杂,不易实现大规模工业化生产。合成生物学的出现,特别是利用酿酒酵母进行萜类化合物的异源生物合成为远志皂苷的获得提供新方法。酿酒酵母生长速度快,易于基因工程操作,适合大规模培养,工业化控制简便,尤其是其能提供天然的合成萜类的前体2,3-氧化角鲨烯,为通过改造酿酒酵母异源生物合成萜类提供便利。本课题组前期验证了一个合成远志皂苷前体齐墩果酸的细胞色素P450单加氧酶CYP716A249(cytochrome P450 monooxygenase CYP716A249,简称CYP716A249或PtOAS)。通过在酿酒酵母W303a中引入新疆光果甘草(Glycyrrhiza glabra)的β-AS(GgbAS,Genbank:AB037203.1)、百脉根(Lotus japonicus)CPR(LjCPR,Genbank:AB433810)和蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)OAS(MtOAS,Genbank:FN995113.1),CYP716A249(PtOAS,Genbank:KY385302.1),采用双酶切连接构建质粒的方式成功将质粒pRS304-ADH1p-PtOAS-ADH1t-ALA1p-LjCPR-ALA1t转入到产β-香树脂醇的酿酒酵母中,通过代谢物检测,获得齐墩果酸的含量为1.32 mg/L。再通过过表达内源关键酶基因ERG20,齐墩果酸的含量反而降低,为0.13 mg/L。推测原因可能为酿酒酵母体内转入过多的质粒,使酿酒酵母的负荷过重,难以为后续外源引入的质粒提供能量,导致产量下降。因此,基于酿酒酵母体内高效的DNA同源重组能力,本研究通过酿酒酵母转化耦联重组(Transformation-associated recombination,TAR)技术,即基因同源重组技术调控酿酒酵母内源基因及引入外源基因,构建产β-香树脂醇及齐墩果酸的酿酒酵母工程菌;基于实时荧光定量PCR技术(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)和气相色谱-质谱联用(Gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)、超高效液相-质谱联用(Ultra Performance Liquid Chromatography-mass spectrometry,UPLC-MS)代谢物检测技术从mRNA水平和代谢物水平分析不同酿酒酵母工程菌株中和齐墩果酸生物合成相关基因及代谢物的含量,分析外源基因在酿酒酵母中生物合成规律;通过比较酶切连接(菌株前缀RL-)和同源重组法(菌株前缀HR-)改造酿酒酵母对代谢物积累的影响,分析提高代谢物产量的原因。以上研究为远志皂苷在酿酒酵母中的生物合成提供新方法,并为构建远志P450s的酿酒酵母在体功能研究体系奠定基础。目的:1.利用基因同源重组技术改造酿酒酵母,构建产β-香树脂醇的酿酒酵母工程菌株HR-β-AS,为后续OAS等基因表达盒的转入提供前体。2.改造酿酒酵母,引入百脉根LjCPR,构建为后续P450s提供电子的酿酒酵母工程菌株HR-LjCPR。3.分别引入苜蓿MtOAS和远志PtOAS,构建酿酒酵母工程菌株HR-MtOAS和HR-PtOAS,调控内源基因ERG20,构建提高齐墩果酸产量的酿酒酵母工程菌株HR-MtOAS-ERG20和HR-PtOAS-ERG20。4.分析同源重组技术构建的菌株和酶切连接法构建菌株对齐墩果酸的含量影响。方法:1.利用基因同源重组技术的原理扩增出目的基因的同源重组表达元件。2.将上述目的基因的同源重组表达元件,包括筛选标记分别依次转入酿酒酵母W303a中,构建不同酿酒酵母工程菌株。3.通过qRT-PCR和GC-MS、UPLC-MS技术对相关基因及代谢物进行定量,分析不同构建方式对目标代谢物产量的影响。结果:1.利用同源重组技术的原理扩增出5个基因(β-AS、LjCPR、PtOAS、MtOAS与ERG20)的同源重组表达元件。2.成功构建产β-香树脂醇的酿酒酵母HR-β-AS,为P450s提供电子的酿酒酵母HR-LjCPR,产齐墩果酸的酿酒酵母HR-PtOAS和HR-MtOAS,调控内源基因,提高齐墩果酸产量的HR-PtOAS-ERG20和HR-MtOAS-ERG20。3.通过qRT-PCR测定β-AS和OAS的mRNA表达量,结果显示与酶切连接构建菌株相比,OAS基因的mRNA表达量均在同源重组构建的菌株中高。在增加了ERG20后,除RL-PtOAS菌株中OAS的mRNA表达量外,同源重组和酶切连接构建的菌株中β-AS和OAS基因的mRNA表达量均比未加之前表达量高。4.通过比较酶切连接和同源重组法改造酿酒酵母后齐墩果酸等代谢物的积累情况,结果显示,HR-MtOAS中β-香树脂醇的含量为4.74 mg/L,比RL-MtOAS中的含量高了3.5倍;齐墩果酸的含量为10.98 mg/L,比RL-Mt OAS高了13倍;HR-PtOAS比RL-PtOAS中β-香树脂醇的含量高了2.4倍,齐墩果酸含量高了20倍;在增加了前体供应的ERG20后,HR-MtOAS-ERG20中β-香树脂醇的含量为4.85 mg/L,比RL-Mt OAS-ERG20中高了2.2倍,齐墩果酸含量为20.44 mg/L,比RL-MtOAS-ERG20中高了10倍;HR-Pt OAS-ERG20中β-香树脂醇的含量为3.92 mg/L,比RL-PtOAS-ERG20低了2.2倍,齐墩果酸含量为15.34 mg/L,比RL-PtOAS-ERG20中高了100倍之多;最关键的是,在通过基因同源重组技术调控内源基因ERG20后,齐墩果酸的含量没有下降,说明同源重组是一种比酶切连接更为适合改造酿酒酵母,获得天然产物的构建方式。结论:本研究利用基因同源重组技术改造酿酒酵母构建合成原远志皂苷元的下游关键酶基因的酿酒酵母菌株,为萜类化合物在酿酒酵母中的异源生物合成提供新方法,为后续与远志皂苷生物合成相关的P450s在酿酒酵母中的功能鉴定提供基础。