蛋白质内含子(Intein)是指前体蛋白中的一段插入序列，它在蛋白质翻译后的成熟过程中自我催化，使自身从前体蛋白中切除，并将其两侧的多肽片段(N-端蛋白质外显子和C-端蛋白质外显子)以肽键连接，形成成熟的蛋白质。截至目前，已经有500多种蛋白质内含子被发现。典型的蛋白质内含子包含400多个氨基酸，不仅具有蛋白质剪接功能，还有核酸转移酶活性。而微小蛋白质内含子只有140个氨基酸左右，并且只有蛋白质剪接功能。这两类蛋白质内含子的剪接反应称为蛋白质顺式剪接反应(cis-splicing)。断裂型蛋白质内含子(split-intein)是微小蛋白质内含子的断裂形式，每个断裂蛋白质内含子包括两个片段：N-端蛋白质内含子(IN)和 C-端蛋白质内含子(IC)，这两个片段表达后可以相互识别并发生蛋白质剪接反应，称这类蛋白质剪接反应为反式剪接反应(trans-splicing)。由于断裂型蛋白质内含子的两个片段可以分别与其两端的外显子独立表达后在体外将它们剪接起来，所以这类蛋白质内含子已经被广泛的应用到蛋白质研究和蛋白质工程中。例如，这项技术可以应用到蛋白质定点修饰、同位素修饰蛋白质片段、蛋白质环化、基因治疗、蛋白质芯片等研究中。　　自然界中存在天然断裂蛋白质内含子，还可以认为地将微小蛋白质内含子改造成断裂蛋白质内含子。天然断裂蛋白质内含子在微小蛋白质内含子的中部位置断裂，称之为S0型断裂蛋白质内含子；新型断裂蛋白质内含子的断裂位点靠近微小蛋白质内含子的 N-端或 C-端，分别称为 S1(IN~12 aa， IC~140 aa)或S11(IN~150 aa，IC~6 aa)型断裂蛋白质内含子。而且，由于S1型断裂蛋白质内含子的IN和S11型断裂蛋白质内含子的IC比较小，易于化学合成，从而简化了蛋白质内含子在蛋白质修饰和诱导蛋白质断裂等方面的应用。在本论文中，首次获得Cysteine free(无半胱氨酸)型断裂蛋白质内含子，并基于新型断裂蛋白质内含子，开发出蛋白质N-末端和C-末端的定点修饰方法，同时对MBP、GST、SUMO、diUb和ERp44蛋白进行定点修饰。　　在以往的研究中，S11型断裂蛋白质内含子曾被用于蛋白质C-末端修饰，然而这种蛋白质内含子的IN(IN~150 aa)必须与目的蛋白融合表达。较大的IN会影响目的蛋白的正常表达、折叠和可溶性，从而限制了这种方法的广泛应用。为了解决这个问题，我们开发了一种新型蛋白质C-末端修饰方法：首先对Ssp GyrB和RmaDnaB S1型断裂蛋白质内含子进行基因突变，将这两种蛋白质内含子IC(IC~140 aa)中所有半胱氨酸(Cysteine)突变成丝氨酸(Serine)。检测这两种断裂蛋白质内含子的剪接活性，结果显示突变后的RmaDnaB S1有剪接活性，突变后的SspGyrBS1无剪接活性。然后对突变后的RmaDnaB S1进行更深入的体外剪接活性研究，其剪接动力学常数为5.15±0.27×10-4 s-1，最高剪接效率为84％。为了验证这种方法分别以MBP、GST和SUMO蛋白为目的蛋白进行C-末端修饰，检测的修饰效率分别为：41.2%、53.4%和66.8%。这种新方法有两个优点：1)比较小的 IN(~12 aa)与目的蛋白融合表达，对目的蛋白的表达、折叠和可溶性影响较小；2) IC内无半胱氨酸，且在C-端外显子上仅有的一个半胱氨酸。任何有巯基活性的化学基团可以被修饰到此半胱氨酸上，并通过蛋白质反式剪接反应，定点修饰到目的蛋白C-末端。　　在以往的研究中，S1型断裂蛋白质内含子可以用于蛋白质N-末端修饰。在这种方法中，首先采用化学方法合成IN(IN~12 aa)以及N-端外显子，并将化学基团合成到 N-端外显子的氨基酸侧链上，进一步通过蛋白质反式剪接将带有化学基团的N-端外显子连接到目的蛋白的N-末端。然而，通常会遇到带有化学基团的多肽难溶于水、合成多肽无剪接活性等问题。为了解决这些问题，本论文在大肠杆菌中表达S1型断裂蛋白质内含子的IN及其N-端外显子，并将化学基团定点修饰到外显子的半胱氨酸侧链上，通过蛋白质反式剪接，将化学基团定点修饰到蛋白质的N-末端。为了实现这一目的，必须保证S1型蛋白质内含子的IN没有半胱氨酸，且在 N-端外显子中有唯一的半胱氨酸用于化学基团修饰。首先选我们择TerThyX S1断裂蛋白质内含子，并将其IN中的半胱氨酸突变成丝氨酸，在N-端外显子中保留唯一的半胱氨酸用于化学基团修饰。这种新型断裂蛋白质内含子在大肠杆菌体的剪接活性为20%。基于该蛋白质内含子，我们开发了新的蛋白质 N-端修饰方法：通过简单的重组表达、修饰和纯化得到带有荧光基团的小肽；蛋白质剪接反应结束后，荧光基团被特异的修饰到蛋白质的 N-端。为了验证这个方法，GST蛋白作为目的蛋白进行N-端修饰，修饰的效率为12.3%。这种新方法有其独特的优势：1)不需要化学合成带有修饰物的多肽，该步骤复杂，成本高，特别是需要对目的蛋白修饰多种化学修饰物。2)相比化学合成的多肽，大肠杆菌表达的多肽片段水溶性好，且剪接活性更高。　　蛋白质多位点的特异性修饰有助于了解蛋白质的结构与功能，特别是在蛋白的动态构像研究方面。为了开发新的蛋白质多位点特异性修饰方法，本论文尝试同时利用 S1和 S11两种断裂蛋白质内含子实现蛋白质两个位点的特异性修饰。以di-Ub(ubiquitin dimer)蛋白为研究对象，di-Ub与S1的IC(~140aa)和S11的IN(~150 aa)融合表达。将两个不同的化学基团修饰到S1IN(~12 aa)和S11IC(~6 aa)的外显子序列上。通过蛋白质重组表达、修饰和纯化以及合成带有另一种荧光基团的小肽，两种荧光基团分别被剪接修饰到靶蛋白的N-端和C-端。这种方法的好处是：1)通过一步反应可实现蛋白两端的特异性修饰，操作方法简捷；2)避免了对靶蛋白进行突变改造以及其导致蛋白失活的可能。　　蛋白质剪接技术还可以为基础理论研究提供新工具和方法。内质网滞留蛋白(ERp44)是二硫键异构酶家族中的一员ERp44，通过滞留过程(Retention process)对蛋白质进行质量控制。最近的研究显示，在pH为中性的ER中，ERp44的C-端尾巴会覆盖疏水区域和活性中心，ERp44无活性；在pH较低的cisGolgi中， C-端尾巴会舒展开，露出底物结合位点，ERp44有活性。如果ERp44蛋白C-端尾巴可以被同位素或者荧光基团定点修饰，ERp44 C-端尾巴的动态与结构的关系可以通过NMR(Nuclear magnetic resonance)和FRET(Fluorescence resonance energy transfer;NMR)等技术进行进一步研究。为了完成对ERp44蛋白的片段化同位素标记，首先通过在大肠杆菌体内的反式剪接反应，筛选到了具有高剪接活性的断裂蛋白质内含子和将其插入到 ERp44蛋白中的位点，即在 ERp44 S350位置插入Cne Prp8断裂蛋白质内含子，剪接效率接近100%。随后，构建应用于体外剪接的N-前体蛋白(ERp441-350-IN)和C-前体蛋白(IC-ERp44351-377)。N-前体蛋白在2 YT培养基中表达，产量为38mg/L培养基，C-前体蛋白在M9培养基中表达，并且可以在此培养基中引入同位素(15N，14C)，得到标记蛋白的产量为16 mg/L培养基。两种前体蛋白发生蛋白质反式剪接反应后，剪接产物为完整的ERp44蛋白，剪接效率为84%。在这个蛋白中1-350 aa为普通蛋白，在NMR检测中没有信号。351-377 aa是同位素(15N，14C)修饰的蛋白，可以在NMR中检测到信号。最后，为了完成对ERp44蛋白C-末端进行荧光基团修饰用于FRET研究，我们利用RmaDnaB S1蛋白质内含子的反式剪接反应，得到的修饰的效率为95%。此项研究为揭开ERp44蛋白的结构与功能之间的关系提供了新途径。　　本论文主要涉及新型断裂蛋白质内含子的构建，并基于新型断裂蛋白质内含子开发出多种蛋白质定点修饰方法，且利用这些方法对 MBP、GST、SUMO和ERp44蛋白进行定点修饰。这些研究不仅从理论上增加了目前人们对蛋白质内含子的认识，并且提供了更丰富的蛋白质研究及蛋白质工程的工具和方法，有利于生物医药和蛋白质化学等领域的发展，尤其是长效蛋白质药物和抗体偶联药物领域。