猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea,PED）是由猪流性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的一种急性、高度接触性的肠道传染性疾病。该病主要以哺乳仔猪严重腹泻、呕吐、脱水及死亡率高达100%为特征,各年龄阶段的猪均易感,是目前危害全球养猪业的最主要疾病之一。PEDV N蛋白是一种与病毒复制和转录相关的磷酸化蛋白。在病毒感染早期,宿主能够产生抗N蛋白的抗体,该蛋白是早期诊断和疫苗研发的靶蛋白之一,且被认为是抗病毒的靶蛋白。纳米抗体因具有分子量小、亲和力高、结构稳定、生产成本低以及可识别特殊抗原表位等优点而被视为诊断和治疗性药物研发的理想候选者。基于以上背景,本研究旨在通过噬菌体展示技术筛选到PEDV N蛋白特异性纳米抗体,并鉴定特异性纳米抗体的活性。本研究的主要内容如下:1.PEDV N蛋白噬菌体文库的构建及其多样性的鉴定。利用PEDV N重组蛋白结合弗式佐剂免疫成年雄性阿拉善双峰驼,经过4次免疫后,骆驼血清中PEDV N蛋白的特异性血清效价达到1:128000。采集双峰驼外周血液并进行淋巴细胞分离,提取总RNA并反转录成c DNA,利用巢式PCR扩增VHH基因,将其连入p CANTAB 5E载体后电转入TG1感受态细胞中,得到库容约为6.28×10~8pfu/m L的VHH噬菌体展示文库。随机挑取96个单菌落进行菌液PCR和阳性单克隆测序,结果显示该文库的重组率高达91%,氨基酸序列同源性为34%,这表明该文库多样性丰富。2.PEDV N蛋白特异性纳米抗体的筛选及鉴定。利用M13K07辅助噬菌体对构建的文库进行拯救并测定其滴度。以PEDV N蛋白作为抗原,经过3轮淘选,成功获得3株不同的针对N蛋白的特异性纳米抗体。通过ELISA鉴定,其中纳米抗体Nb2具有较好的特异性及结合力。3.纳米抗体Nb2的原核表达及活性鉴定。构建重组原核表达载体“p ET21b-Nb2”,将其转化入BL21（DE3）感受态细胞中,进行纳米抗体Nb2的诱导表达,SDS-PAGE和western blot分析表明Nb2重组蛋白可高水平表达,且以包涵体的形式存在。经过Ni-NTA柱亲和层析纯化,得到纯度较高的Nb2重组蛋白。间接ELISA表明纳米抗体Nb2具有良好的特异性。间接免疫荧光和western blot结果显示表达纯化的纳米抗体Nb2与PEDV具有良好的反应性。综上所述,本研究首次筛选到PEDV N蛋白特异性纳米抗体,为开发新型的抗PEDV药物和临床快速诊断试剂盒提供了有用的实验数据,并为研究PEDV致病机理及抗病毒机制提供了研究工具。