双氢青蒿素调控HMGB2表达影响肝癌细胞生物学效应的作用及机制

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目的:观察双氢青蒿素(Dihydroartemisinin,DHA)对体外生长的肝癌细胞生物学行为的影响,从DHA调节高迁移率族蛋白B2(High mobility group box 2,HMGB2)的表达,影响Akt/m TOR通路、上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关蛋白的变化等方面探讨其可能的机制,从而为临床筛选以HMGB2为靶点的肝癌治疗新药提供新的思路和途径。方法:体外培养人肝癌细胞HepG2和LM3,采用不同浓度的DHA处理,设立不加药的阴性对照组并以顺铂作为阳性对照。应用四甲基偶氮唑蓝(Methyl Thiazol yl Tetrazolium,MTT)法、流式细胞术分别检测DHA对肝癌细胞增殖及凋亡的影响;划痕实验、侵袭(Transwell)实验分别观察DHA对肝癌细胞迁移及侵袭能力的影响;蛋白免疫印迹(Westernblot,WB)法检测DHA对肝癌细胞凋亡相关蛋白、HMGB2及EMT相关蛋白表达量的影响。下一步应用RNAi技术处理HepG2和LM3细胞,HMGB2 siRNA组转染敲低HMGB2序列的RNA寡核苷酸(RNA oligonucleotide,RNA oligo),以转染无关序列的RNA oligo作为阴性对照(Negative control,NC)。采用qPCR检测肝癌细胞HMGB2 mRNA的表达情况,进行干扰效果的验证;划痕实验、侵袭实验观察HMGB2下调对肝癌细胞迁移及侵袭能力的影响;WB检测HMGB2下调对Akt/mTOR通路及EMT相关蛋白表达的影响。结果:DHA处理后的肝癌细胞存活率降低、凋亡率增加,迁移及侵袭能力降低,与阴性对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05);DHA处理组的肝癌细胞HMGB2蛋白表达显著降低,凋亡相关蛋白Cleaved-caspase3、Bax显著增加,Bcl-2显著减少,EMT相关蛋白E-cadherin显著增加,N-cadherin、Vimentin显著减少,与阴性对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。敲低HMGB2后的HMGB2 m RNA及蛋白表达量降低,与NC组相比,差异具有统计学意义(P<0.05);敲低组肝癌细胞侵袭及迁移能力降低,与NC组相比,差异具有统计学意义(P<0.05);细胞敲低HMGB2后EMT相关蛋白N-cadherin、Vimentin蛋白表达量明显降低,E-cadherin表达量明显升高,Akt/mTOR通路Akt、p-Akt和mTOR明显减少,与NC组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:DHA可以抑制肝癌细胞生长,促进肝癌细胞凋亡,降低肝癌细胞的迁移及侵袭能力,其机制可能是DHA通过降低HMGB2的表达,抑制Akt/mTOR通路从而影响肝癌细胞EMT进程。
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