胶质芽孢杆菌质粒的稳定性及其生物学特性

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胶质芽孢杆菌因具有溶钾解磷固氮等多种功能,已广泛应用于农业生产,在冶金、陶瓷、废水处理等领域也显示了广阔的应用前景。迄今,有关胶质芽孢杆菌分子机制研究一直较薄弱,导致高效菌株的筛选和优化缺乏有效的筛选标记,功能调控与工程菌的构建和分子改造也缺乏理论依据,严重制约了菌种性能的提高及其应用。本论文探讨了胶质芽孢杆菌质粒的稳定性及生物学特性,并初步探索了质粒的功能,为其分子机制研究奠定初步基础。   首先,在确定胶质芽孢杆菌质粒提取方法的基础上,检测了20株胶质芽孢杆菌的质粒。以麦芽糖为碳源,添加2‰(NH4)2SO4,在Aleksandrov培养基中培养14~16h的菌体,用四种方法--碱裂解法、改进Kronstacl法、SDS法、试剂盒分别提取胶质芽孢杆菌质粒,结果试剂盒和SDS法适于胶质芽孢杆菌质粒的提取,其中试剂盒法提取的质粒纯度较高,适用于后续分子生物学实验,SDS法稳定性好,适用于质粒检测。采用SDS法检测20株胶质芽孢杆菌的质粒,发现16个菌株含有约7000bp的质粒pBM1,其中菌株BM2另含有一个约6000bp的质粒pBM2。酶切图谱分析表明,质粒pBM1和pBM2均可被Bam.I、PstI、HindIII和Eco.V等酶切,酶切位点为1~2个。可见,胶质芽孢杆菌中普遍存在环状质粒pBM1。荧光扫描法粗略测定了胶质芽孢杆菌BM2质粒的拷贝数,结果质粒pBM1(7kb)的平均拷贝数为11,质粒pBM2(6kb)的平均拷贝数为10,表明菌株BM2的质粒为低拷贝质粒。   胶质芽孢杆菌稳定性较差是影响其应用的一个重要因素。以菌株BM2和BM4为材料,考察了胶质芽孢杆菌质粒在各种条件下的稳定性,结果胶质芽孢杆菌质粒在不同营养(碳源、氮源)、培养条件(温度、盐度)及连续转接过程中都较稳定。30~37℃培养,菌株BM2和BM4的质粒保持稳定;40℃培养,质粒稳定性显著降低;菌株BM2耐盐性差(<1%NaCl),0.1~0.6.NaCl对菌株BM2的质粒无影响;氮源、碳源对菌株BM2和BM4生长及其质粒没有影响;传代对菌株BM2或BM4的生长及质粒均无影响,连续转接30次后,菌株固氮、溶磷解钾活性在转接前后无差别。可见,胶质芽孢杆菌的质粒具有较高的稳定性。   采用SDS-高温法和吖啶橙法分别对胶质芽孢杆菌BM2进行质粒消除。37℃高温结合不同浓度SDS处理菌株BM2,0~0.002%SDS抑制菌株生长,其致死浓度为0.0025%.SDS处理后,菌株BM2的菌落直径比对照大。吖啶橙处理,显著抑制菌株生长;200μg.ml-1处理48h,致死率100%。但两种处理均不能将质粒pBM1和pBM2消除,表明这两种方法不适用于胶质芽孢杆菌的质粒消除。比较含质粒菌株7519、BM2和无质粒菌株1.3714、SB的生长、固氮、溶磷解钾活性,结果发现含质粒菌株的生长情况、固氮活性及溶磷解钾活性均高于无质粒菌株,表明质粒与固氮、溶磷解钾活性具有一定的相关性,但该质粒的确切功能有待于进一步研究。
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