由于生态环境的不断恶化、人为的过度捕杀等诸多因素的影响，导致很多野生动物品种灭绝或处于濒临灭绝状态，品种的灭绝意味着进行细胞和分子生物学研究基本材料的永远丧失。为此，从保护生物多样性和保存种质资源的实际出发，利用现代生物技术以构建重要、濒危动物品种群体细胞库的方式来保存其基因资源，已成为21世纪诸多研究领域中至关重要的技术支撑和保障，具有深远的科学意义。正常体细胞只能有限增殖，胚胎干细胞具有的无限分裂增殖特性，是保存基因遗传资源的理想载体。传统的方法分离培养胚胎干细胞来源于囊胚的内细胞团或生殖脊的原始生殖细胞，这对于野生动物来说取材相当困难。近年出现的转导多能相关转录因子基因诱导多能干细胞为卵母细胞和胚胎难以获得的野生动物的保护带来了新的希望。　　 马鹿(Re.deer)是分布最广的鹿科动物，中国有8个亚种，天山亚种(C.elaphussongaricuss)主要分布在天山东部。近年由于自然环境变迁和开发利用，适合马鹿栖息的生境不断缩小，加之过度捕猎、牲畜争食等多种原因，主要马鹿亚种资源野生状况均不容乐观，已被列入国家二级保护动物名录。　　 本课题利用现代生物技术，分离培养建立野生天山马鹿皮肤成纤维细胞系，探讨重编程野生天山马鹿皮肤成纤维细胞，建立马鹿多能性干细胞系的可能性，为野生动物保护探索新的方法和途径，结果如下：　　 (1)以DMEM(低糖)各DMEM/F12各45％+10％FBS+1.MEM非必需氨基酸+2mML-Glu+8.IU/ml庆大霉素为培养液，用组织块植块培养成功从野生天山马鹿耳朵皮肤分离培养得到原代马鹿成纤维细胞(RDF)。利用对酶的敏感性不同对培养物进行了纯化，得到典型的呈梭型的成纤维细胞系，细胞群体倍增时间为42.2.h。　　 (2)用血清饥饿和培养到100％汇合度对RDF进行GO/G1期诱导，凋亡染色检测结果表明血清饥饿后细胞凋亡显著高于100％汇合度细胞，血清饥饿法不适于马鹿细胞用于体细胞核移植前G0/G1期诱导。　　 (3)从屠宰场获得牛卵巢采集卵丘-卵母细胞复合体培养1.h体外成熟，盲吸法去核后移植入RDF，电融合后用离子霉素和6-DMAP激活，在mSOF中培养，7d后得到种间核移植囊胚，证明成熟牛卵母细胞胞质成分可以重编程RDF细胞核。与牛同种体细胞核移植胚胎相比，囊胚发育率低(15.1.V.22.5％)，囊胚细胞数少(68 V.83.8)。　　 (4)以293T为包装细胞，LipofectamineT.2000共转染pMD.G、pCMVdeltaR8.91和LV-转导载体获得了携带人转录因子OCT4，SOX2，NANOG和LIN28的慢病毒，ELISA测定滴度达到10.LPs/ml。将携带GFP的慢病毒感染RDF，与大鼠心脏细胞相比较，RDF对慢病毒不易感染。经嘌呤霉素药物筛选实验及转基因蛋白表达分析表明，用直接收获的新鲜病毒液感染RDF(4.6×10.LPs/cell)，目的基因未在细胞中表达，以5倍剂量(2.3×105LPs/cell)感染RDF，有约50％细胞表达转基因。转基因后2周出现克隆样团块，但挑出培养不增长，慢病毒载体转入的OCT4、SOX2、NANOG和LIN28诱导RDF为iPS细胞的方案暂未获成功，其主要原因可能是：a)RDF对慢病毒不易感；b)人的转录因子能否对马鹿基因表达起到调控作用还有待进一步研究：c)有待于寻找适于马鹿ESCs的培养体系。