脊髓损伤（Spinal Cord Injury，SCI）的修复，是神经科学临床研究与基础研究的重要课题。我们已在临床上开展损伤早期（伤后4~14d）髓内清创减压术的研究，获得了满意的效果；回到相关的基础研究，为促进进一步功能恢复和组织保护，药物干预SCI后继发损伤机制的研究就尤为重要。其中，药物干预炎症机制，尤其是针对炎症反应的双刃剑式作用（加重损伤/促进修复），如巨噬细胞的M1/M2极化，是我们的重点方向。枸杞多糖（Lycium Barbarum Polysaccharide，LBP），为传统中药枸杞的水溶性提取物，其已知的功能，除直接的神经保护和抗氧化作用，还可调节免疫功能，而神经损伤、氧化应激和免疫机制均为SCI中导致继发损伤的重要机制。但目前针对LBP在脊髓损伤中的作用尚无直接证据。脊髓损伤研究面临的另外一个重要问题在于病理变化复杂且细微，因此，建立重复性和稳定性好的动物模型至关重要。目前，大鼠脊髓损伤模型中以撞击伤和挤压伤模型最为常用。虽然两者都可很好地模拟临床脊髓损伤的病理过程，但它们都存在自损伤部位起，沿脊髓长轴向髓内远端分布的出血，该成分随病程进行性变化，且范围和程度难以控制，是建立稳定模型所必须解决的问题。对于上述髓内损伤远端出血的成因，目前尚无合理统一的解释。因此本研究的第一部分在大鼠脊髓挤压损伤模型对此进行了探讨。针对脊髓撞击伤和挤压伤模型存在的问题，本研究的第二部分根据前一部分结果，针对一种脊髓夹伤模型进行改良，最大限度降低远端出血的干扰，获得病理过程相对稳定的大鼠脊髓损伤模型，为后续实验奠定了基础。在模型研究基础上，本研究的第三部分针对LBP在大鼠脊髓损伤的治疗作用展开研究，尤其关注了LBP对SCI后的免疫调节和组织保护的作用机制。第一部分：脊髓挤压损伤中髓内远端出血的成因。脊髓挤压损伤模型是以重物缓慢压迫脊髓，造脊髓腹背向完全受压。经组织学观察：伤后6h和3d，在脊髓损伤位置以远可见明显出血，其具体位于后索内皮质脊髓束与其背侧白质之间。我们于损伤即刻，在损伤区域吻尾端切断脊髓后索，结果表明，至伤后3d，远端出血未出现；于损伤即刻在损伤中心注射碳粉，结果示，在伤后6h远端出血内可见碳粉存在。该结果提示，远端出血来源于损伤中心出血的直接扩散，而不是形成于远处血管结构的直接受损；其分布特征的形成，可能与后索内皮质脊髓束及其背侧白质有关。所以，避免该远扩出血关键可能在于控制损伤区的出血程度。第二部分：在夹伤模型避免远扩出血，获得一种稳定的大鼠脊髓损伤模型。鉴于第一部分的结果，为避免远扩出血，我们采用镊子从两侧夹伤脊髓造模，选择该模型是因为：1）便于调整挤压程度，即通过设置最终脊髓夹伤状态时镊子两刃保留的间距来调节夹伤程度；2）挤压力从两侧向内作用到脊髓，减轻牵扯后索内的皮质脊髓束。我们造不同程度的脊髓夹伤，即设置镊子在脊髓夹伤状态下最终保留的间距分别为0.2，0.5或0.8mm，比较损伤即刻出血范围：在0.5mm的损伤，损伤中心主要为一梭形出血灶，无远扩出血，损伤结果稳定，个体差异小（变异率10.4%）；其他损伤程度，过重（镊子间距0.2mm）可致远扩出血，过轻（镊子间距0.8mm）可间接增强系统误差的影响，个体间差异均较大（变异率：0.2mm，22%；0.8mm，55%）。在上述0.5mm的夹伤中，出血主要分布脊髓灰质内，所以两侧灰质内出血占总出血绝大部，中央管附近灰质内出血占小部。我们在不同矢状切面分别统计出血范围并统计动物间个体差异，其中，在包含了一侧灰质主要部分的切面内的出血范围，其个体差异（变异率8%）明显低于中央管附近切面（变异率17%）。在伤后7d，0.5mm损伤仍造成稳定的继发损伤，包括损伤范围（变异率9.9%）、损伤旁区残留神经元数量（变异率10.2%）、少突细胞凋亡数量（变异率13.5%）、巨噬/小胶质细胞活化（变异率11%）。所以，0.5mm的夹伤可避免远扩出血，所致原发损伤个体差异小，为一种稳定的脊髓损伤模型。其中，两侧灰质内的损伤结果尤为稳定，可作为良好的观察对象。第三部分：LBP对大鼠脊髓夹伤的作用方法：动物实验在上述大鼠脊髓夹伤模型开展（镊子间距0.5mm）。LBP给药方案有两种，分别针对各自目的：LBP-pre，因LBP起效慢，且已有LBP的动物实验都在疾病模型建立前数天即开始给药，所以，为保证损伤即刻LBP即开始起效和便于与以往的LBP研究结果比较，我们从损伤前第7d开始给药，至处死动物取材；LBP-aft，在脊髓损伤后7d开始给药至实验结束，该部实验视LBP为SCI后的一项治疗性干预进行研究。对照组分别在同时刻给双蒸水，所有药物经胃给予。在LBP-pre组的伤后7d和14d以及LBP-aft组的伤后14d，Western Blotting（WB）检测ED1，iNOS（M1型极化巨噬/小胶质细胞标志）和Arg1（M2型极化巨噬/小胶质细胞标志）；形态学检测包括：损伤区面积（以GFAP强阳性标记为边缘），在损伤旁区（GFAP边缘以外一定范围内）比较GFAP和ED1（人CD68的大鼠同型物，活化巨噬/小胶质细胞标志）免疫荧光强度，并计数ED1+iNOS+（M1型极化巨噬/小胶质细胞）和ED1+Arg1+（M2型极化巨噬/小胶质细胞）细胞；细胞培养是为进一步验证在体实验中关于胶质瘢痕和巨噬/小胶质细胞的结果，包括大鼠原代星形胶质细胞和N9小胶质细胞系的培养。原代星形胶质细胞，给予处理：LBP v.s.空白对照；LBP联合TNFα+IFNγ+LPS v.s.TNFα+IFNγ+LPS。在免疫细胞染色检测荧光强度，结合WB，比较GFAP表达差异。其中，已知TNFα+IFNγ+LPS可刺激星形胶质细胞活化。N9细胞大体包括2部分实验：1）为明确LBP以及LBP联合LPS+IFNγ（刺激巨噬细胞M1极化）或IL-4（刺激巨噬细胞M2极化）对N9细胞极化的影响，分别一次性给予以下处理：LBP v.s.空白对照；LBP联合LPS+IFNγ v.s. LPS+IFNγ；LBP联合IL-4v.s. IL-4。2）为在N9细胞模拟动物实验中LBP-pre和LBP-aft，接连给予N9细胞两种不同的刺激，每种刺激持续1d。“LBP-pre”：1st d，LBP，2nd d，LBP联合LPS+IFNγ+IL-4；对照组每天给予无LBP的相同刺激。“LBP-aft”：1st d，LPS+IFNγ+IL-4，2nd d，LBP联合LPS+IFNγ+IL-4；对照组每天给予无LBP的相同刺激。WB检测iNOS和Arg1水平。结果：损伤区范围的结果出乎我们意料：LBP-pre组在7d和14d均较其对照组损伤面积扩大(7d:1.30v.s.0.97,14d:1.17v.s.0.75mm2)；LBP-aft则相反，伤后14d损伤面积较对照缩小(0.56v.s.0.80mm2)。为解释上述LBP对损伤组织损伤的相反影响，开展以下实验：星形胶质细胞为胶质瘢痕主要成分，直接影响损伤区变化，原代星形胶质细胞和在体结果示，各种给药方式下的LBP对GFAP表达均没有影响。ED1是巨噬/小胶质细胞活化的标志之一。 LBP-pre较对照组，在7d和14d，ED1荧光强度均增加，且该荧光强度增加与损伤范围扩大成正相关，WB亦示，LBP-pre动物ED1表达水平在7d和14d均高于对照组；但LBP-aft动物较对照组，在伤后14d的ED1荧光强度和WB均未见差别。ED1结果仍不能完全解释损伤范围的变化，于是我们转向巨噬/小胶质细胞的M1/M2极化（iNOS/Arg1）。iNOS和Arg1：动物实验，WB结果示：LBP-pre较对照组，在7d和14d，均上调iNOS，下调Arg1，iNOS/Arg1比值增加；LBP-aft较对照组，在14d，iNOS和Arg1均增加，但后者增加的幅度更大，所以iNOS/Arg1比值减小。因iNOS也可表达于中性粒细胞、神经元等，我们行免疫荧光染色以明确iNOS/Arg1比值是否反应M1/M2变化：损伤旁区内iNOS和Arg1主要表达在ED1+细胞，LBP-pre的给药组较对照ED1表达上调，M1细胞增多，M2细胞减少，M1/M2比例上调。LBP-aft的治疗组较对照M1无明显差异，M2细胞增多，M1/M2比例下降。在N9，LBP或LBP联合IL-4均较各自对照组，iNOS水平提高，Arg1下降，虽然LBP联合LPS+IFNγ与其对照间未见差别。在模拟在体LBP-pre和LBP-aft给药方案的N9细胞实验，“LBP-pre”较对照组，仍为iNOS上调，Arg1下调；但“LBP-aft”较对照组，反而iNOS下降，Arg1增加。综上，LBP-pre和LBP-aft分别加重组织受损和促进组织修复。鉴于SCI中M1极化加重组织受损，M2极化促进组织修复，M1/M2比值则决定巨噬/小胶质细胞的“好坏”，所以两种给药方式下LBP对巨噬细胞极化的影响差别可能解释其对组织损伤的作用。虽然LBP-pre加重SCI后组织损伤，但LBP-aft可促进组织修复，从临床应用的角度考虑，LBP仍为安全有效的治疗药物，可应用于脊髓损伤，抑制脊髓组织继发受损。