目的：研究鼠心肌细胞条件培养液（myocardial cells culture medium，CMCM）的体外抑瘤作用及其分子机制，并分析不同温度和蛋白酶处理对CMCM活性的影响，初步探讨其理化性质，为后期分离提纯抑瘤活性成分提供一定的理论依据和向导，为心肌源性天然抗肿瘤物质应用于鼻咽癌等肿瘤的治疗提供实验依据。方法：1.收集成纤维细胞条件培养液、平滑肌细胞条件培养液、骨骼肌细胞条件培养液、心肌细胞条件培养液。将上述条件培养液作用于人鼻咽癌CNE-2细胞, CCK8法检测作用48h后的细胞存活率的情况。计算细胞存活率,绘制柱状图。2.用1:1的心肌细胞条件培养液原液，1:2稀释的心肌细胞条件培养液，1:4稀释的心肌细胞条件培养液，1:8稀释的心肌细胞条件培养液及1:16稀释的心肌细胞条件培养液分别干预培养人鼻咽癌CNE-2细胞12,24,36,48小时，以不具有抑瘤作用的成纤维细胞条件培养液作为阴性对照，采用CCK8法检测细胞存活情况，计算细胞存活率,并绘制生长曲线。3.以心肌细胞条件培养液干预培养肿瘤细胞（鼠源性肺腺癌细胞Lewis，高转移大细胞肺癌细胞L9981，人宫颈癌细胞Hela，人鼻咽癌细胞CNE-2）及正常细胞（大鼠肝细胞BRL，鼠肾小球系膜细胞MCs）48小时后，采用CCK8法检测细胞存活情况，计算细胞存活率。4.采用6孔板及Transwell嵌套构建心肌细胞与CNE-2细胞或鼠正常肝细胞BRL的共培养模型，观察CNE-2细胞或BRL细胞单独培养或与心肌细胞共同培养时的形态学特征。5.以不具有抑瘤作用的成纤维细胞条件培养液作为阴性对照，观察不同温度（4℃、25℃、50℃、100℃）处理心肌细胞条件培养液（CMCM）原液后，CMCM对CNE-2细胞生长的影响情况。计算细胞存活率,绘制柱状图。6.以不具有抑瘤作用的成纤维细胞条件培养液作为阴性对照，观察不同蛋白水解酶（胰蛋白酶或链霉蛋白酶）处理心肌细胞条件培养液（CMCM）原液后，CMCM对CNE-2细胞生长的影响情况。计算细胞存活率,绘制柱状图。7.采用TUNEL试剂盒和DAPI染色剂检测CMCM原液干预CNE-2细胞0,12,24,48小时后的细胞凋亡情况，计算各处理时间点的凋亡率，绘制柱状图。8.根据前期基因芯片结果的提示，采用Real-time PCR法检测CMCM原液干预CNE-2细胞48小时后，CNE-2细胞内8个凋亡相关基因（Caspase3、Bim、PERP、ENDOG、PPP3R1、THAP1、CCAR1、AATF）的mRNA的表达情况。9.根据Real-time PCR法的验证结果，筛选出5个感兴趣的凋亡相关基因（Caspase3、Bim、PERP、ENDOG，P53），用Western blot法检测其蛋白表达情况。结果：1.成纤维细胞培养液和平滑肌细胞条件培养液作用于CNE-2细胞48h后细胞存活率分别为105.56±7.53%和116.00±7.00%，与阴性对照组比较无显著差异(P>0.05)；而骨骼肌细胞条件培养液和心肌细胞条件培养液作用CNE-2细胞48h后细胞存活率则分别为35.90±9.20%和35.00±3.42%，阴性对照组相比有统计学差异（P<0.05），两者之间比较无统计学差异(P>0.05)。2.12小时时，CMCM原液及1:2稀释的CMCM已表现出对CNE-2细胞的生长抑制作用（P <0.05）,且浓度较高的CMCM组相较浓度较低的1:2稀释组对CNE-2细胞的生长抑制率更大，但两者之间无统计学差异（P=0.18）。24小时、36小时、48小时组的CMCM原液、1:2稀释组以及24小时的1:4稀释组均表现出对CNE-2细胞生长的明显抑制（P <0.05），其内部之间的差异也具有统计学意义（P <0.05），这种抑制作用随药物浓度的降低而减小，表现出一定的浓度依赖性;随用药时间的延长而增强，表现出一定的时间依赖性。由于较高比例稀释后，CMCM已无明显抑制细胞生长作用（P>0.05），较高比例稀释组未见明显药物作用的时间、浓度依赖关系。3.心肌细胞条件培养液对肿瘤细胞Lewis、L9981、Hela、CNE-2的生长有不同程度的抑制作用，作用上述细胞48后的细胞存活率分别为64.69±15.86%，45.90±5.50%，42.97±6.45%，39.10±4.0%，与阴性对照组相比有统计学差异（P <0.05），而对于正常细胞BRL、MCS的细胞存活率无显著影响(P>0.05)。4.共培养结果发现：鼻咽癌CNE-2细胞或正常人肝细胞BRL单独培养时，细胞紧贴6孔板底部，呈扁平、多边、铺路石样外观，细胞间紧密连接成片，细胞较大，胞质丰富。与心肌细胞共同培养后，正常肝细胞形态无明显改变，但鼻咽癌细胞体积缩小，胞质透亮，胞核固缩，部分细胞变圆，变小，贴壁能力下降甚至脱壁，培养基中可见较多的脱壁细胞漂浮，6孔板底部细胞分散，数量降低，表现出类似凋亡的形态学变化。5. CCK8法检测发现：不同温度（4℃、25℃、50℃、100℃）处理后的CMCM仍然具有对CNE-2细胞生长的抑制作用（P <0.05），各组存活率分别为45.05±6.18%，43.91±4.66%，49.39±5.39%，49.96±5.04%，各处理组之间对细胞存活率的影响无统计学差异（P﹥0.05）。6.不同蛋白水解酶（胰蛋白酶或链霉蛋白酶）处理心肌细胞条件培养液（CMCM）原液后，CMCM对CNE-2细胞仍具有生长抑制作用，其抑制率与未处理的CMCM组无统计学差异（P﹥0.05）。7.采用TUNEL试剂盒检测CMCM原液干预CNE-2细胞不同时间后CNE-2细胞的凋亡情况，结果显示：未经CMCM作用的CNE-2细胞凋亡细胞数极少,凋亡率仅：2.04±0.65%，而经CMCM作用后的CNE-2细胞,凋亡细胞数明显增多,且随着作用时间的延长,凋亡率逐渐增加：CMCM作用CNE-2细胞12h后的凋亡率为：10.17±3.04%；24h后的凋亡率为：19.60±5.84%；48h后的凋亡率为：33.80±4.23%，各组与阴性组相比，差异均具统计学意义，呈现出时间依赖关系。8. Real-time PCR在mRNA水平上验证到了CMCM原液干预CNE-2细胞48小时后的6个表达上调的凋亡相关基因：Caspase3、Bim、PERP、ENDOG、PPP3R1、THAP1及1个表达下调的凋亡相关基因AATF，基因芯片验证符合率为：87.5%。9.根据Real-time PCR结果，Western blot法在蛋白水平上验证了5个凋亡相关基因：Bim、Caspase3、P53、PERP、ENDOG的表达，结果显示表达上调，与Real-time PCR的结果相符。结论：1.心肌源性抑瘤物可能成为一种安全有效的抗肿瘤药物。2.心肌细胞条件培养液中抑瘤活性物质对热、蛋白酶具有较好的稳定性。3.心肌细胞条件培养液的抑瘤机制与诱导凋亡有关。4.心肌细胞条件培养液诱导凋亡的分子机制可能与上调Bim、Caspase3、P53、PERP、ENDOG的表达有关。