研究背景：当肾脏遭受一段时间完全缺血的损伤之后,获得了血液的再次灌注时,其功能失常、代谢受阻及结构的破坏却较缺血状态下更加明显,导致肾脏功能反而愈加受损的病理生理状态被称为缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury, IRI),是医生在工作中经常遇到的一种病理生理问题。失血性休克、肾脏移植手术、体外震波碎石后均可能引起肾脏IRI,是急性肾功能衰竭的重要发病环节。由于肾脏IRI可以导致细胞信号传导障碍以及功能失常,进而引起细胞凋亡与坏死病变,不仅严重影响病人肾脏功能的康复,甚至还可能导致患者很高的死亡率。因此如何降低肾脏IRI所引起的严重损害,促进患者机体恢复,已经成为IRI防治研究上的一个重要焦点。缺血再灌注损伤是一种由诸多因素导致的复杂疾病进程,缺血所造成的损伤可以引起细胞产生亚致死性的严重损伤,在再灌注时又被各种细胞内来源的活性氧作用加重了损害,另外大量炎性介质的形成与释放、各种炎性细胞的聚集与活化进一步加重机体损伤,而微循环堵塞状态还可使局部区域失灌流而使得病情更加恶化。目前国内外大多采用针对肾脏IRI某一损伤途径的拮抗剂的防治手段,但不能从多个环节共同作用而发挥协同效应。所以,我们认为不能仅仅对肾脏IRJ机制中的某一介质或单一机制采取保护方法,而要采取综合性的肾脏保护手段才有可能达到更加良好的防治效果。实验目的：首先利用SD大鼠成功构建单侧肾脏缺血再灌注损伤的动物模型,从而研究肾脏缺血再灌注损伤的发病机理。本研究通过观察匹立尼酸联合缺血后处理措施对大鼠肾脏缺血再灌注损伤的保护作用及其机制,为临床工作中肾脏缺血再灌注损伤时的防治保护探索一种更合理的思路与方法,更有效地减轻肾脏损害、保护肾脏功能。实验材料与方法：第一部分：健康雄性SD大鼠50只,随机平均分成对照组(S组)、缺血20分钟再灌注组(IR20组)、缺血40分钟再灌注组(IR40组)、缺血60分钟再灌注组(IR60组)、缺血80分钟再灌注组(IR80组)共5组,每组为10只。操作方法如下：S组大鼠麻醉成功后切去大鼠右侧肾脏,但不予完全阻断左侧肾动脉的操作。IR20组大鼠麻醉后切去大鼠右侧肾脏,用无创血管夹完全阻断左侧肾动脉,使得左侧肾脏完全缺血,20分钟后即移去血管夹实施动脉血再灌注,其余三组大鼠分别于40分钟、60分钟、80分钟后松开动脉夹,逐层缝合切口。各组大鼠均于手术后24小时采集血液样本,用全自动分析仪检测血肌酐和尿素氮的含量。根据各组大鼠行无限制再灌注24小时后,肾功能严重损伤且大鼠存活>80%来确定符合本研究要求的肾蒂阻断时间。第二部分：健康雄性SD大鼠90只,随机平均分成假手术对照组(S组),缺血再灌注组(IR组),1mg/kg匹立尼酸治疗组(PA1组),5mg/kg匹立尼酸治疗组(PA5组),10mg/kg匹立尼酸治疗组(PA10组)等5组,每组大鼠均为18只。具体操作方法如下：S组大鼠麻醉后切去大鼠右侧肾脏,但不予完全阻断左侧肾动脉。IR组大鼠麻醉后切去大鼠右侧肾脏,用无创血管夹完全阻断左侧肾动脉,使得左侧肾脏完全缺血,60分钟后移去血管夹实施动脉血再灌注,建立单侧肾脏缺血再灌注损伤动物模型。PA1组：在左侧肾脏缺血操作前30分钟,腹腔给药匹立尼酸1mg/kg,其余操作同IR组。PA5组：在左侧肾脏缺血操作前30分钟,腹腔给药匹立尼酸5mg/kg,其余操作同IR组。PA10组：在左侧肾脏缺血操作前30分钟,腹腔给药匹立尼酸10mg/kg,其余操作同IR组。各组大鼠都在手术后4小时集取腹主动脉血5毫升,大鼠血清中肌酐与尿素氮水平用全自动生化分析仪检测,丙二醛与超氧化物歧化酶浓度分别以硫代巴比妥酸法与黄嘌呤氧化酶法检测。第三部分：健康雄性SD大鼠90只,随机平均分成假手术对照组(S组),缺血再灌注组(IR组),缺血后处理1组(IPO1组),缺血后处理2组(IP02组),缺血后处理3组(IP03组)等5组,每组大鼠均为18只。具体操作方法如下：S组大鼠麻醉后切去大鼠右侧肾脏,但不予完全阻断左侧肾动脉。IR组大鼠麻醉后切去大鼠右侧肾脏,用无创血管夹完全阻断左侧肾动脉,使得左侧肾脏完全缺血,60分钟后移去血管夹实施动脉血再灌注,建立单侧肾脏缺血再灌注损伤动物模型。IPO1组：在完全阻断左侧肾动脉60分钟后,于再灌注前予以大鼠左侧肾脏短暂再灌注30秒及夹闭肾动脉30秒的处理措施,之后再恢复左侧肾动脉血流完全灌注,其余操作同IR组。IP2组：在完全阻断左侧肾动脉60分钟后,于再灌注前予以大鼠左侧肾脏短暂再灌注15秒及夹闭肾动脉15秒,共采用2个循环,之后再恢复左侧肾动脉血流灌注,其余操作同IR组。IPO3组：在完全阻断左侧肾动脉60分钟后,于再灌注前予以大鼠左侧肾脏短暂再灌注10秒及夹闭肾动脉10秒,共予以3次循环,之后再恢复左侧肾动脉血流灌注,其余操作同IR组。各组大鼠都在手术后4小时集取腹主动脉血5毫升,用全自动生化分析仪检测大鼠血清中肌酐与尿素氮水平,丙二醛与超氧化物歧化酶浓度分别以硫代巴比妥酸法与黄嘌呤氧化酶法检测。第四部分：健康雄性SD大鼠90只,随机平均分成假手术对照组(S组),缺血再灌注组(IR组),匹立尼酸治疗组(PA组),缺血后处理组(IPO组),匹立尼酸联合缺血后处理组(PAIPO组)等5组,每组大鼠均为18只。具体操作方法为：S组大鼠麻醉后切去大鼠右侧肾脏,但不予完全阻断左侧肾动脉。IR组大鼠麻醉后切去大鼠右侧肾脏,用无创血管夹完全阻断左侧肾动脉,使得左侧肾脏完全缺血,60分钟后移去血管夹实施动脉血再灌注,建立单侧肾脏缺血再灌注损伤动物模型。PA组：在缺血操作前30分钟,腹腔给药匹立尼酸5mg/kg,其余操作同IR组。IPO组：在完全阻断左侧肾动脉60分钟后,于再灌注前短暂灌注10秒+夹闭肾动脉10秒,共予以3次循环,之后再恢复左侧肾动脉血流灌注,其余操作同IR组。PAIPO组：于缺血前30分钟,给予匹立尼酸5mg/kg腹腔注射,夹闭左侧肾动脉60分钟,在再灌注前行短暂灌注10秒+夹闭肾动脉10秒,共计循环3次,之后再恢复血流。各组大鼠都在手术后4小时集取腹主动脉血5毫升及左侧肾脏样本。观察大鼠肾脏HE染色后在光镜下的变化情况,血清中肌酐与尿素氮水平用全自动生化分析仪检测,丙二醛与超氧化物歧化酶浓度分别以硫代巴比妥酸法与黄嘌呤氧化酶法检测,应用酶联免疫吸附法检测肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β的浓度,肾脏细胞间粘附分子1的表达情况以免疫组织化学方法观察,初步探索肾脏损伤的产生与发展机理。实验结果：1.本实验中左肾蒂钳夹时间为60分钟的大鼠,在再灌注24小时后大鼠存活率大于80%,且血清尿素氮和肌酐指标均显著升高,提示有明显的IRI发生,所以本实验采用左肾蒂钳夹60分钟的方法建立大鼠肾脏IRI模型,效果稳定良好。本试验中以剂量为5mg/kg的匹立尼酸防治大鼠肾脏IRI,大鼠血清肌酐、尿素氮及丙二醛、超氧化物歧化酶指标,与1mg/kg匹立尼酸组差异显著与10mg/kg匹立尼酸组无显著差异,所以本实验采用剂量为5mg/kg的匹立尼酸防治大鼠肾脏IRI,效果明显。本研究中以在肾脏再灌注前行再灌注10秒+夹闭肾动脉10秒,共循环3次的缺血后处理措施防治大鼠肾脏IRI,大鼠血清肌酐、尿素氮及丙二醛、超氧化物歧化酶指标与其他缺血后处理方式相比较显著差异,所以本实验采用在肾脏再灌注前行再灌注10秒+夹闭肾动脉10秒,共循环3次的缺血后处理措施,效果良好。2.肾脏病变的肉眼大体观察情况：S组大鼠肾脏标本未见显著变化。IR组大鼠再灌注肾脏标本损害显著,可见肾脏色泽暗红灰暗,外观肿胀,肾脏包膜紧张,膜下有少量出血点。IPO组和PA组以及PAIPO组的大鼠肾脏大体变化类似,肾脏的颜色均稍显灰暗,外观轻度肿胀。光镜下HE染色观察情况：S组大鼠肾脏肾小球肾小管未见显著变化。IR组大鼠再灌注肾脏组织损害显著,光镜下可见肾小管上皮细胞肿胀,广泛变性坏死及基底膜破裂,肾脏间质充血水肿并发现大量炎性细胞。PA组和IPO组肾脏组织光镜下观察发现肾小管变性坏死程度比IR组轻微,基底膜无明显病变,而PAIPO组光镜观察仅发现了少量肾小管上皮细胞变性的情况。3.S组血清BUN、Cr等反映肾功能的指标维持在较低水平，IR组BUN、Cr与S组比较差异具有显著性意义(P<0.05)；PA组和IPO组BUN、Cr对比无显著性差异(P>0.05),分别与IR组比较,BUN和Cr均明显降低,存在显著性差异(P<0.05),但仍高于S组的水平(P<0.05); PAIPO组BUN、Cr水平比S组高(P<0.05),与IR组、PA及IPO组相比较均明显下降,其差异显著(P<0.05)。4.S组中,血清MDA、TNF-α、IL-1β含量维持在较低水平；IR组中,MDA、TNF-α、IL-1β含量明显升高,与S组比较,差异具有显著性意义(P<0.05)；PA组与IPO组MDA、TNF-α、 IL-1β对比无显著性差异(P>0.05),分别与IR组比较,MDA、TNF-α、IL-1β含量明显降低,均存在显著性差异(P<0.05),但仍高于S组(P<0.05)；PAIPO组MDA、TNF-α、 IL-1β显著降低,但高于S组(P<0.05),与其余组比较,仍明显降低,存在显著性差异(p<0.05)。5.S组中,血清SOD活性维持正常水平；IR组SOD活性明显降低,与S组比较具有显著性差异(P<0.05)。PA组与IPO组SOD两组对比无显著性差异(P>0.05),分别与IR组比较,SOD活性明显升高,均存在显著性差异(P<0.05)；PAIPO组SOD显著升高,但高于S组(P<0.05),与其余组比较,仍明显降低,存在显著性差异(p<0.05)。6.经免疫组织化学染色后光镜下观察,在S组大鼠肾脏组织中未发现ICAM-1明显表达,R组大鼠肾脏组织中可见至(?)CAM-1显著表达,PA组和IPO组表达减弱,PAIPO组表达更弱。我们测定平均光密度值(MOD)来定量地代表ICAM-1阳性表达情况,IPO组和PA组的MOD值高于PAIPO组(P<0.05),高于对照组S组(P<0.05),低于IR组的MOD值(P<0.05)；IPO组与PA组比较无显著性差异(P>0.05)。实验结论：1.大鼠单侧肾脏在完全阻断血流供应60分钟后,即可产生明显的缺血再灌注损伤现象,不但BUN、Cr等肾功能损伤指标显著升高,肾组织病理学损害亦十分明显。2.自由基是肾脏缺血再灌注损伤的重要损害因素之一,MDA水平升高显著反映了肾组织中自由基的大量产生,SOD活性明显下降显示体内自由基清除不良,MDA、SOD的水平的变化情况间接反映了肾脏的损害情况。3.匹立尼酸或者缺血后处理可以明显改善肾脏缺血再灌注对肾脏功能与组织结构的损伤,治疗效果显著,其效果与提高SOD活性且降低MDA水平,减少TNF-α、IL-1β等细胞因子分泌并减少ICAM-1表达等有关。4.匹立尼酸及缺血后处理两种处理因素对大鼠肾缺血再灌注损伤的保护有协同作用。