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前列腺癌是欧美国家男性最常见的恶性肿瘤之一，早期局限性前列腺癌一般采用手术或局部放疗，而晚期多采用内分泌治疗，但随着时间的延长，很多患者发展为去势抵抗性前列腺癌。 免疫治疗（疫苗或细胞因子）是治疗肿瘤的有效途径之一。本实验将链亲和素标记的mGM-CSF(SA-mGM-CSF)锚定在生物素化的肿瘤细胞表面，成功制备一种新型肿瘤细胞疫苗。研究表明该疫苗具有较好的疗效，但疫苗治疗后肿瘤微环境中的Treg细胞也明显增加。Treg细胞是一群具有免疫抑制功能的T细胞亚群，参与肿瘤免疫逃逸。因此，抑制或清除Treg细胞必将有效提高抗肿瘤免疫反应。近期研究发现，ICOS+Treg是发挥免疫抑制作用的主要Treg亚群。前期的研究发现，体外活化ICOS信号可显著促进Treg细胞的增殖和免疫抑制功能。基于以上研究结果，提出设想：采用ICOS封闭性抗体靶向清除Treg细胞，从而提高疫苗的疗效。 去甲斑蝥素(NCTD)具有很强的抗肿瘤能力，能抑制多种肿瘤细胞的增殖并诱导其凋亡。NCTD具有区别于普通化疗药物的最显著特点，即NCTD具有升白作用，可减少化疗后的骨髓抑制。近期有报道称，NCTD还具有免疫调控作用，但对Treg细胞的影响报道罕见。 研究目的： 1.探究ICOS封闭性抗体是否可以靶向清除Treg细胞，提高SA-mGM-CSF膜修饰的前列腺癌细胞疫苗的疗效。 2.探究NCTD对Treg细胞增殖和凋亡的影响，以及NCTD联合SA-mGM-CSF膜修饰的前列腺癌细胞疫苗治疗小鼠前列腺癌的疗效。 研究方法： ICOS封闭性抗体联合SA-mGM-CSF肿瘤细胞疫苗治疗前列腺癌：C57BL/6雄鼠的右后腿腹股沟区皮下注射RM-1前列腺癌细胞，建立皮下前列腺癌模型，随后观察成瘤效果并记录肿瘤大小。随机将小鼠分为四组(PBS，Vaccine，Vaccine+IgG mAb和Vaccine+ICOS mAb组)，于肿瘤细胞接种后的第12天开始，每隔4天皮下注射一次疫苗，共4次，每隔3天腹腔注射ICOS封闭性抗体100μg，共4次。治疗结束后一周，流式细胞术检测血液中成熟的DC细胞，CD4+、CD8+T淋巴细胞以及ICOS+Treg细胞的含量;免疫组化检测肿瘤微环境中的CD4+、CD8+T淋巴细胞;免疫荧光检测肿瘤组织中的ICOS+Treg细胞以及ELISA检测小鼠血清中的IL-4、IL-10和IFN-γ的含量。 NCTD对Treg细胞增殖和凋亡的影响：采用磁珠分选技术获取Treg细胞。活化性的CD3和CD28抗体刺激细胞，并加入不同浓度(0-80μM)的NCTD作用24h或者20μM NCTD作用0-3天。收集各时间点的细胞，CCK8检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞凋亡。提取20μM NCTD处理后的Treg细胞总蛋白和总RNA，western blot和Real Time PCR分别检测凋亡相关蛋白的蛋白水平和基因水平。 NCTD联合SA-mGM-CSF肿瘤细胞疫苗治疗小鼠前列腺癌：同上述方法建立动物模型。随机分为四组(PBS，NCTD，Vaccine和Vaccine+NCTD组)，于肿瘤细胞接种后的第10天开始，同上方法进行疫苗治疗，同时腹腔注射NCTD10mg/kg/天，连续14天。治疗结束后同上述方法检测DC细胞，CD4+T、CD8+T淋巴细胞以及Treg细胞的含量。 研究结果： 1.ICOS抗体显著提高SA-mGM-CSF肿瘤细胞疫苗的抗肿瘤免疫反应。 与PBS对照组相比，肿瘤疫苗能有效抑制肿瘤生长，小鼠血液和肿瘤组织中的CD4+、CD8+T淋巴细胞明显增多，但肿瘤组织中ICOS+Treg细胞也明显增多。联合ICOS抗体治疗后，肿瘤体积缩减更快，ICOS+Treg细胞明显减少，血液和肿瘤组织中效应T细胞增加更显著，血清中IL-4和IL-10含量显著降低。 2.NCTD体外对Treg细胞的影响。 NCTD显著抑制Treg细胞增殖并诱导凋亡，且呈时间、剂量依赖关系。机制研究发现，NCTD能明显下调p-AKT，从而上调FOXO1、FasL蛋白。Fas、FasL、FOXO3a、FOXO4和FOXO1基因表达水平也明显升高。 3.NCTD显著提高SA-mGM-CSF肿瘤细胞疫苗的抗肿瘤免疫反应。 与PBS对照组相比，疫苗或NCTD单独治疗能有效抑制肿瘤生长，小鼠血液和肿瘤组织中的CD4+、CD8+T淋巴细胞。疫苗治疗后Treg细胞明显增多，而NCTD能减少Treg细胞。联合NCTD治疗后，肿瘤体积缩减更快，Treg细胞明显减少，血液和肿瘤组织中的效应T细胞增加更显著。 研究结论： 1.ICOS封闭性抗体可以通过清除ICOS+Treg细胞，显著提高SA-mGM-CSF膜修饰的前列腺癌细胞疫苗的抗肿瘤效果。 2.NCTD体外能抑制Treg细胞增殖且诱导凋亡，以及NCTD体内能明显减少SA-mGM-CSF膜修饰前列腺癌细胞疫苗诱导的Treg细胞，显著增强其疗效。