基于磁性复合颗粒和化学发光的乙肝分子检测方法的建立及优化

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乙型病毒性肝炎感染是一个全球性的问题,乙肝病毒分子诊断对于乙肝疾病的预防和治疗具有重大的意义。磁性纳米颗粒作为纳米材料的一个重要组成部分,由于其在缓冲体系中具有高比表面积和易分离的特点,目前已被广泛应用于各种生物信号的检测等方面。化学发光具有安全、灵敏度高,线性范围宽等特点,为病毒分子检测提供了一个良好的平台。本论文结合磁性复合颗粒和化学发光技术的优点,建立了一种快速灵敏的乙肝病毒分子检测新方法。具体内容包括:  1.溶剂热法磁性复合颗粒的制备  制备出粒径均匀,分散性良好的Fe3O4颗粒,并在颗粒表面包被SiO2便于进行功能化基团修饰。获得的Fe3O4/SiO2磁性复合颗粒为核壳结构的球形实心均匀颗粒,粒径范围为500-600 nm。  2.磁性复合颗粒全血核酸提取法与血清煮沸裂解法乙肝病毒核酸提取效果的比较  磁性复合颗粒吸附核酸提取法是通过颗粒的磁分离和高比表面积特性对核酸分子进行快速吸附和分离,避免了离心等繁琐步骤,通过多次清洗,可以有效去除抑制扩增的杂质成分,适合于自动化操作。通过磁性复合颗粒全血核酸提取法与血清煮沸裂解法两种方法对乙肝病毒核酸提取效果的对比实验发现,磁性复合颗粒全血核酸提取法提取出的核酸纯度较血清煮沸裂解法高,因此采用颗粒吸附核酸提取法作为本研究中乙肝病毒核酸样本的制备方法。  3.基于磁性复合颗粒的化学发光乙肝病毒模拟片段杂交检测方法的建立及优化  利用Fe3O4/SiO2磁性复合颗粒作为固相载体,表面修饰特异性乙肝病毒基因探针,杂交捕获生物素标记的乙肝病毒模拟核酸片段ssHBV-DNA,与修饰有碱性磷酸酶的链亲合素(streptavidin-ALP)结合,充分洗涤后加入3-(2’-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3”-羟基)苯-1,2-二氧杂环丁烷磷酸(3-(2’-spiroadamantane)-4-methoxy-4-(3”-phosphoryloxy)phenyl-1,2-dioxetane,AMPPD),通过化学发光读板机读取每孔的发光强度,实现了快速特异分析鉴定。随后对相关实验条件进行优化分析,结果表明,乙肝病毒模拟片段检测灵敏度可达1copy/mL,在低浓度范围10-10000 copies/mL内,发光信号强度呈良好的线性关系。  4.基于磁性复合颗粒富集,生物素信号放大和化学发光的乙肝病毒分子检测新方法的建立及优化  通过掺入生物素标记的单体,对磁性颗粒提取的乙肝病毒核酸样本进行扩增标记,利用乙肝病毒模拟片段建立的化学发光检测优化方法,对扩增片段进行检测并对该方法进一步优化。利用优化的实验条件对特定浓度扩增片段进行检测,得出了相应的化学发光信号值,这为化学发光乙肝病毒核酸定量方法的建立提供了新的研究思路。
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