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实验目的:1.研究Ddx5和Ddx17在胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES cell)、诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell,i PS cell)中的作用。2.探究Ddx5和Ddx17在干细胞及重编程中对下游基因的选择性剪接作用。实验方法:为了研究Ddx5和Ddx17在ES及i PS中的作用,首先检测了二者在ES、MEF(mouse embryonic fibroblasts,小鼠胚胎成纤维细胞)中的表达,及构建了带MKO红色荧光的真核表达载体。用此载体建立受Dox(强力霉素)控制的Tet-on调控系统的过表达ES稳转细胞株,并利用PCR、q PCR技术在基因组水平和RNA水平进行检测,同时构建了敲低的载体及用此载体建立了敲低的ES稳转细胞株。利用q PCR方法检测在ES中过表达和敲低Ddx5以及过表达Ddx17对多能性基因表达的影响。另外,用q PCR检测在无LIF(Leukemia Inhibitory Factor,白血病抑制因子)培养的ES分化过程中,Ddx5和Ddx17的基因表达变化。及在过表达、敲低Ddx5和过表达Ddx17,在无LIF培养条件下进行ES分化,检测对Nanog、Oct4等多能性基因及与胚胎发育相关的三个胚层的基因Fgf5、T、Gata6的表达变化。利用构建成功的二次重编程系统小鼠制备MEF。利用MEF细胞在含有Dox的ES培养基中诱导重编程,并用q PCR技术检测在重编程过程中Ddx5和Ddx17的基因表达变化及用流式细胞术和碱性磷酸酶染色检测它们对重编程效率的影响。由于Ddx5、Ddx17的这些不同作用,之后研究了Ddx5和Ddx17对下游基因在干细胞和重编程中的选择性剪接作用。在已发表的文献数据库中查找了大量相关基因,设计引物,收取2天的样品,提RNA进行RT-PCR检测,分析二者对候选基因的选择性剪接变化。对有明显选择性变化的基因进行下一步研究。针对有选择性剪接变化的基因各自的亚型,分别构建真核表达载体,检测其在ES、MEF中的表达及重编程过程中的基因表达变化。研究不同亚型在重编程过程中有什么作用。实验结果:1、真核表达载体及ES稳转细胞株构建成功。1)Ddx5过表达、敲低的真核表达载体及相应的ES稳转细胞株构建成功。2)Ddx17过表达的真核表达载体及ES稳转细胞株构建成功。2、Ddx5和Ddx17在ES中发挥着重要作用。1)与MEF细胞相比,Ddx5在ES中表达高,Ddx17在ES中表达较低。2)过表达Ddx5后,多能性基因表达上调;敲低则相反。过表达Ddx17后,多能性基因表达上调。3)在无LIF培养的ES分化过程中,Ddx5和Ddx17的表达下降,呈递减模式。3、Ddx5和Ddx17在重编程中发挥着重要作用。1)在重编程过程中Ddx5、Ddx17的表达明显上升,呈递增模式。2)过表达Ddx5后可促进重编程效率,敲低则明显降低。3)过表达Ddx17后可降低重编程效率。4、在ES中,过表达Ddx5后对Hras、CD44等有选择性剪接作用;在重编程中对H-ras等有选择性剪接作用。5、在ES、重编程中Ddx5和Ddx17对Hras的选择性剪接作用不同。1)在ES及重编程中发现,过表达Ddx5对Hras有选择性剪接作用,可使亚型2的表达上调,亚型1的表达下调。而Ddx17对Hras无选择性剪接作用。2)在普通MEF(129-rt TA-MEF)中,Ddx5和Ddx17对Hras的选择性剪接变化不明显。6、Hras亚型1的真核表达载体构建成功;Hras总体RNA水平在ES、MEF中的表达变化差异不大;在重编程过程中亚型1的表达逐渐明显上升,呈递增模式。并且Hras总体RNA水平在重编程过程中表达上调。实验结论:Ddx5和Ddx17在ES和重编程过程中都发挥着作用,但是有所不同,它们对下游基因Hras的选择性剪接作用不同。