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副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis, HPS）是猪上呼吸道的一种共栖菌，在特定条件下可侵入机体而引起严重的以多发性浆膜炎、关节炎、脑膜炎、肺炎、高热及高死亡率为主要特征的全身性疾病，被称为副猪嗜血杆菌病或革拉斯氏病（Glasser’sdisease）。该病已经成为影响全球养猪业最为严重的细菌性传染病之一，给养猪业造成了重大经济损失。副猪嗜血杆菌目前已知的血清型有15种，且有大量无法定型的菌株，各型菌株间的毒力差异及致病性差异都很大，且各血清型之间缺乏有效的交叉保护力。此外，HPS的毒力因子尚未完全被定义，这些都为Glasser’s disease的防控及其疫苗的研制带来了很大困难。因此，开展HPS的相关研究对Glasser’s disease的防控就具有重要的现实意义。本研究的主要内容是：①探讨安徽地区HPS分离株的耐药性及其与细菌毒力和血清型、基因型之间存在的关系，为Glasser’s disease的治疗和防控提供科学依据；②探讨TbpA蛋白的免疫保护作用，为HPS新型亚单位疫苗的研制奠定理论基础。本研究内容包括以下部分：1.安徽地区副猪嗜血杆菌的血清型及基因型多态性2008-2011年，自安徽省14个地区（猪场）的病猪病料中分离鉴定了24株副猪嗜血杆菌，采用KRG、ERIC-RCR、PCR-RFLP对分离株的血清型和基因型进行分析。结果显示，24株HPS中以血清学4型最为流行，占29.17%(7/24)，其次为14型和13型分别占12.5%(3/24)和8.33%(2/24)，此外还有50%(12/24)的菌株不能进行定型。ERIC-PCR将24株HPS分为11个基因型，其中Ⅳ为优势血清型，占20.83%(5/24)，其次为基因型Ⅰ和基因型Ⅱ，分别占16.67%(4/24)和12.5%(3/24)；RFLP-PCR将24株HPS分为6个基因型，其中优势血清型为DBP和BBB，分别占37.5%(9/24)和20.83%(5/24)；不能进行血清学分型的菌株均能够得到有效地基因分型。2.副猪嗜血杆菌耐药性研究采用标准Kirby-Bauer纸片法检测了本研究室的24株HPS临床分离株对24种药物的敏感性，同时运用PCR技术检测了分离株中28种耐药基因的分布情况。结果显示，所有菌株对左氟沙星、头孢氨苄、头孢唑林钠、头孢氨噻肟、头孢曲松钠、红霉素、阿奇霉素、庆大霉素、壮观霉素、氟苯尼考、均100%敏感；敏感率较高的有氨苄青霉素(95.8%)、羟氨苄青霉素(95.8%)、氯霉素(95.8%)、青霉素(91.7%)；氧氟沙星、恩诺沙星、头孢拉定、丁胺卡那的敏感率均为(83.3%)；甲氧苄啶和强力霉素的敏感率均为75%；复方新诺明和链霉素的耐药率分别高达58.3%和54.2%；其次耐药率较高的为环丙沙星(41.7%)和四环素(37.5%)。24株HPS临床分离株表现有21种抗菌谱，仅有3株(12.5%)分离株对本试验的所有药物敏感，20.8%的菌株能耐受1-2种药物，66.7%的菌株至少对3种或3种以上的药物不敏感，20.8%的菌株至少对5种药物不敏感，有1株(4.2%)可以耐受7种药物。运用PCR技术检测了副猪嗜血杆菌分离株的28种耐药基因。24株副株嗜血杆菌中有23株检测出耐药基因，检出率为95.8%(23/24)。对基因组和质粒DNA进行28种耐药基因检测，均共检测出13种耐药基因。耐药表型测定结果与耐药基因检测结果基本一致。24株HPS中以血清学4型最为流行，其次为14型和13型，其耐药率分别是14.3%、9.7%、0%。虽然不同血清型间的耐药率相差较大，但由于受检菌株数量的有限，以及大量未定型菌株的存在，使得无法探究HPS的耐药性与其血清型之间的相关性。RFLP分型中的优势血清型为DBP(37.5%)和BBB (20.83%)，其耐药率分别为19.9%和10%。结果表明，优势血清型的菌株耐药性相对较强。比较不同时期的临床分离株对药物耐药性的变化趋势，可见HPS的耐药谱正逐渐拓宽，多重耐药现象也日益严重。3. HPS转铁结合蛋白A基因的克隆、表达及其对豚鼠的免疫保护效力研究参照GenBank登陆的副猪嗜血杆菌SH0165株tbpA基因序列，设计一对特异性引物，采用PCR扩增13型HPS(LJ3株)tbpA全基因，克隆到pET-SUMO原核表达载体，构建重组表达质粒pET-SUMO-tbpA，并转化大肠杆菌Rosetta (DE3)进行诱导表达，经SDS-PAGE电泳可见大小约为110kD的目的蛋白。免疫印迹试验显示重组TbpA蛋白与兔抗HPS(LJ3株)高免血清能够发生特异性反应，表明该蛋白具有免疫反应性。将纯化后的重组蛋白加佐剂乳化分别于第1天、20天免疫豚鼠，以ELISA方法检测免疫前、后豚鼠rTbpA抗体滴度。在首免及二免后，试验组重组TbpA抗体滴度都有升高。Real-time PCR检测二免后血液中细胞因子表达水平的变化，结果显示干扰素γ(IFN-γ)、白介素-2(IL-2)、白介素-5(IL-5)、白介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)都出现显著性升高。二免后三周用血清型4、13型的HPS以致死剂量分别对重组TbpA蛋白免疫组及对照组的豚鼠进行腹腔攻毒，结果表明重组TbpA蛋白对相同血清型的菌株具有较好的免疫保护力，对不同血清型的菌株也具有一定的交叉保护力。