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鸡球虫病是由艾美耳球虫寄生于肠道所引起的一种危害极其严重的寄生虫病,严重影响家禽的生长发育,全世界每年因球虫病造成巨大的经济损失。目前,鸡球虫病的防治主要以药物防治为主,但随着球虫抗药性的出现及药物残留等问题的出现,迫使人们去寻找更有效的防治方法。基因工程疫苗成为研究的热点,而寻找理想的虫体抗原是基因工程疫苗研究的最大难点。1.柔嫩艾美耳球虫BW4-C03、BW1-E03基因cDNA全长克隆分析及BW4-C03基因的原核表达为寻找与鸡球虫发育、入侵相关的作用分子,本实验室利用抑制性消减杂交技术(SSH)和cDNA微阵列技术筛选获得了柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)不同发育阶段的ESTs序列。本研究选择2个孢子化卵囊阶段高表达的EST片段,其克隆号为BW4-C03、BW1-E03,利用RACE技术扩增得到含完整开放阅读框(ORF)的基因cDNA全长序列。经同源性比对,BW4-C03与柔嫩艾美耳球虫mRNA表面抗原23(EtmRNA-SAG 23)和表面抗原21(EtmRNA-SAG21)均有82%同源性,其编码的蛋白与柔嫩艾美耳球虫表面抗原19(EtSAG19)和表面抗原20(EtSAG20)分别有75%和72%同源性,推测该蛋白属于柔嫩艾美耳球虫表面抗原,命名为EtSAG。BW1-E03与柔嫩艾美耳球虫mRNA表面抗原13同源性达100%,命名为EtSAG13。此外,利用生物信息学软件对这两个基因的理化性质、信号肽、疏水性、跨膜结构、抗原位点、保守结构等进行了预测和分析。Real-time PCR检测2个基因在未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子、裂殖子4个发育阶段和不同孢子化时间(6 h、12 h、20 h、30 h、48 h)的表达情况,结果显示BW4-C03和BW1-E03都为孢子化卵囊高表达基因,在培养孢子化48 h的转录拷贝数最高。进一步构建了EtSAG的原核表达重组质粒(pET-28C-EtSAG),获得重组蛋白经Western-blot检测具有良好的抗原性。2.柔嫩艾美耳球虫ZB10-E05基因的克隆表达及特性分析本研究选取子孢子阶段高表达的EST片段,克隆号为ZB10-E05,利用RACE技术获得含ORF的基因cDNA全长序列。经同源性比对,其编码的蛋白与刚地弓形虫的核酸内切酶/核酸外切酶有40%同源性,未见与球虫同源性的数据,提示该基因可能是鸡球虫中未报道的新基因。进一步构建该基因的原核表达质粒(pGEX-4T-2-E05),获得原核表达产物,命名为E05,经Western-blot检测显示该蛋白具有良好的免疫原性。本研究对ZB10-E05基因表达蛋白的功能进行了初步研究。将重组蛋白E05免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,利用间接免疫荧光试验分析目的蛋白在柔嫩艾美耳球虫子孢子体外接种鸡胚成纤维细胞(DF-1细胞)后不同发育阶段虫体的定位分布情况。结果显示,入侵初始阶段目的蛋白主要分布在虫体的顶端及中部;子孢子入侵48 h,可以看到该蛋白主要位于带虫空泡,且虫体入侵24～48 h蛋白的表达量明显高于其它阶段,推测该蛋白与子孢子入侵宿主细胞有关。为了验证该蛋白是否与子孢子入侵有关,利用流式细胞仪进行了体外抑制实验。将纯化后的多抗IgG按50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL分别与子孢子孵育2 h后接入DF-1细胞,结果显示随着抗体浓度的升高,子孢子进入宿主细胞的入侵率也逐渐降低,说明该蛋白与子孢子的入侵相关。3.重组蛋白E05对鸡球虫免疫保护实验为了分析重组蛋白E05的免疫保护效果,将重组表达蛋白E05分别以50μg/只、100μg/只2次肌肉注射免疫雏鸡,最后一次免疫后7 d用柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊1×10~4/只攻击,通过盲肠病变记分、相对增重、卵囊减少率、细胞免疫水平和体液免疫水平等指标,对其免疫保护效果进行综合评价。结果显示在增重、卵囊减少率及盲肠病变记分方面,免疫组均好于感染不免疫对照组,且高剂量(100μg /只)免疫组的保护效果总体好于低剂量免疫组(50μg /只)。鸡体在一免后7 d,免疫组产生了较高的抗体水平,并可持续较长时间。提示重组蛋白具有一定的免疫保护力。