目的:铁是细菌生长和代谢的必需营养物质,胞内铁含量升高有利于细菌的繁殖。本研究在发现沙门菌质粒毒力基因spvB与细胞铁代谢密切相关的基础上,进一步探讨其分子机制。第一部分通过建立鼠伤寒沙门菌野生株SL1344、突变株SL1344-ΔspvB和回补株SL1344-c-spvB感染的小鼠巨噬细胞RAW264.7和小鼠胚胎成纤维细胞MEF模型,分析spvB影响细胞铁代谢的机制,为阐明spvB促进宿主菌胞内繁殖提供新思路。第二部分应用CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建敲除核转录因子Nrf2基因的小鼠巨噬细胞系,为探索NRF2在spvB影响细胞铁代谢中的作用提供研究工具和手段;应用该细胞系建立感染模型,分析NRF2/FPN途径在spvB影响细胞铁代谢从而促进宿主菌胞内繁殖中的作用,为深入研究spvB致病机制和防治沙门菌感染提供理论和实验依据。方法:第一部分沙门菌质粒毒力基因spvB通过影响细胞铁代谢促进宿主菌胞内繁殖的机制研究1.细胞铁代谢在沙门菌质粒毒力基因spvB促进宿主菌胞内繁殖中的作用鼠伤寒沙门菌野生株SL1344、突变株SL1344-ΔspvB和回补株SL1344-c-spvB按感染复数(multiplicity of infection,MOI)10:1与RAW264.7细胞共培养,建立细胞感染模型。感染后2 h、4 h和8 h,平板菌落计数法检测胞内活菌计数,分析spvB对宿主菌胞内繁殖的影响;感染后2 h、4 h和8 h,比色法检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放量,分析spvB对细胞损伤的影响;用柠檬酸铁铵、硫酸亚铁和去铁酮预处理细胞30 min后,按上述方法建立细胞感染模型,感染4 h后平板菌落计数法检测胞内活菌计数,分析细胞铁代谢在spvB促进宿主菌胞内繁殖中的作用。2.沙门菌质粒毒力基因spvB影响细胞铁代谢的机制上述三株受试菌分别按MOI 10:1和5:1与RAW264.7细胞和MEF细胞共培养,建立细胞感染模型。感染后2 h、4 h和8 h,qPCR和Western Blot检测铁摄取相关蛋白——转铁蛋白受体(transferrin receptor 1,TFRC)和二价金属离子转运蛋白1(divalent metal transporter 1,DMT1)以及铁释放唯一蛋白——膜铁转运蛋白(ferroportin,FPN)表达水平,分析spvB对细胞铁代谢相关蛋白的影响。3.沙门菌质粒毒力基因spvB影响FPN的机制上述细胞感染模型中加入转录抑制剂放线菌素D,感染2 h后qPCR检测Fpn表达水平,分析spvB是否在转录水平影响FPN表达;感染后2 h、4 h和8 h,qPCR和Western Blot检测调控Fpn转录的核转录因子——核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid-derived 2-related factor 2,NRF2)、缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor,HIF)和金属调节转录因子1(metal-regulatory transcription factor 1,MTF1)表达水平,分析spvB影响FPN的机制。第二部分沙门菌质粒毒力基因spvB通过NRF2/FPN途径影响细胞铁代谢的机制研究1.Nrf2基因敲除小鼠巨噬细胞系的构建应用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Nrf2基因敲除RAW264.7细胞。针对Nrf2基因设计一对GC%不同的sg RNA,以p UC57质粒为模板进行PCR扩增后连接至T载体,获得sg RNA重组载体;sg RNA重组载体与p GL3质粒经酶切、纯化回收、连接、转化和鉴定,获得p GL3-sg RNA重组质粒;应用电转化系统将p GL3-sg RNA重组质粒和Cas9质粒导入RAW264.7细胞,经筛选单克隆和鉴定后获得Nrf2基因敲除RAW264.7细胞。2.NRF2/FPN途径在沙门菌质粒毒力基因spvB影响细胞铁代谢中的作用上述三株受试菌按MOI 10:1分别与RAW264.7细胞和Nrf2-/-RAW264.7细胞共培养,建立细胞感染模型。感染2 h后qPCR检测Fpn表达水平,分析NRF2在spvB影响FPN转录中的作用。将上述三株受试菌按MOI 10:1与RAW264.7细胞共培养,建立细胞感染模型。感染4 h后免疫荧光观察NRF2与胞核共定位,比较不同感染组胞核NRF2表达差异;感染4 h后分别提取胞浆蛋白和胞核蛋白,Western Blot检测胞浆和胞核NRF2表达水平,分析spvB抑制FPN转录的机制。3.沙门菌质粒毒力基因spvB不同结构域对NRF2的影响为进一步明确spvB不同结构域对NRF2的影响,将上述三株受试菌、敲除spvB羧基端的突变株SL1344-spvBΔC-terminal和敲除spvB氨基端的突变株SL1344-spvBΔN-terminal分别按MOI 10:1与RAW264.7细胞共培养,建立细胞感染模型。感染2 h后Western Blot检测NRF2表达水平,分析spvB不同结构域在spvB影响细胞铁代谢中的作用。结果:第一部分沙门菌质粒毒力基因spvB通过影响细胞铁代谢促进宿主菌胞内繁殖的机制研究1.细胞铁代谢在spvB促进宿主菌胞内繁殖中的作用SL1344感染组和SL1344-c-spvB感染组胞内活菌计数显著高于SL1344-ΔspvB感染组,表明spvB促进宿主菌的胞内繁殖;SL1344感染组和SL1344-c-spvB感染组LDH释放量显著高于SL1344-ΔspvB感染组,表明spvB可加重细胞损伤;用柠檬酸铁铵、硫酸亚铁和去铁酮处理后,SL1344感染组和SL1344-c-spvB感染组胞内活菌计数与SL1344-ΔspvB感染组无统计学差异,表明细胞铁代谢在spvB促进宿主菌的胞内繁殖中起重要作用。2.沙门菌质粒毒力基因spvB影响细胞铁代谢的机制qPCR结果显示,SL1344感染组和SL1344-c-spvB感染组在感染早期Tfrc和Dmt1表达水平与SL1344-ΔspvB感染组无统计学差异,提示spvB影响细胞铁代谢可能与细胞铁摄取的生物学过程不相关;但SL1344感染组和SL1344-c-spvB感染组在感染早期Fpn表达水平显著低于SL1344-ΔspvB感染组,且Western blot检测FPN的结果与qPCR结果一致,提示spvB可能通过抑制FPN表达阻止细胞铁释放致胞内铁含量升高。3.沙门菌质粒毒力基因spvB影响FPN的机制经放线菌素D处理后,SL1344感染组和SL1344-c-spvB感染组Fpn转录水平与SL1344-ΔspvB感染组无统计学差异,提示spvB在转录水平调控FPN表达;qPCR结果显示,未发现SL1344感染组和SL1344-c-spvB感染组Hif-1α和Mtf1表达水平低于SL1344-ΔspvB感染组,提示spvB抑制FPN表达可能与HIF-1α和MTF1不相关;但SL1344感染组和SL1344-c-spvB感染组Nrf2表达水平在感染早期显著低于SL1344-ΔspvB感染组,且Western blot检测NRF2的结果与qPCR结果一致,提示spvB通过抑制NRF2从而下调FPN转录水平。第二部分沙门菌质粒毒力基因spvB通过NRF2/FPN途径影响细胞铁代谢的机制研究1.Nrf2基因敲除小鼠巨噬细胞系的构建菌落PCR鉴定结果显示已成功构建sg RNA重组载体;酶切鉴定和DNA测序鉴定结果显示已成功构建p GL3-sg RNA重组质粒;Western blot鉴定结果显示已成功构建Nrf2基因敲除小鼠巨噬细胞系。2.NRF2/FPN途径在沙门菌质粒毒力基因spvB影响细胞铁代谢中的作用qPCR结果显示,Nrf2-/-RAW264.7细胞感染模型中SL1344感染组和SL1344-c-spvB感染组Fpn表达水平与SL1344-ΔspvB感染组无统计学差异,表明spvB通过NRF2/FPN途径影响细胞铁代谢;免疫荧光结果显示,SL1344感染组和SL1344-c-spvB感染组胞核中NRF2表达水平显著低于SL1344-ΔspvB感染组;Western blot结果显示,SL1344感染组和SL1344-c-spvB感染组胞浆和胞核中NRF2表达水平均显著低于SL1344-ΔspvB感染组,该结果与免疫荧光结果一致,提示spvB通过阻止NRF2进入胞核从而抑制Fpn转录。3.沙门菌质粒毒力基因spvB不同结构域对NRF2的影响Western blot结果显示,SL1344-spvBΔN-terminal感染组NRF2表达水平低于SL1344-ΔspvB感染组,且与SL1344感染组和SL1344-c-spvB感染组无统计学差异;而SL1344-spvBΔC-terminal感染组NRF2表达水平与SL1344-ΔspvB感染组无统计学差异,且高于SL1344感染组和SL1344-c-spvB感染组,提示spvB抑制NRF2激活主要由其羧基端结构域介导。结论:1.沙门菌质粒毒力基因spvB通过影响细胞铁代谢,在促进宿主菌的胞内繁殖中发挥重要作用。2.沙门菌质粒毒力基因spvB通过阻止NRF2进入胞核,抑制FPN表达从而限制胞内铁外排,导致铁含量升高有利于宿主菌的繁殖。3.沙门菌质粒毒力基因spvB抑制NRF2激活主要由其羧基端结构域介导。