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目的近来,在肿瘤学研究发现启动子区高甲基化异常是导致许多肿瘤抑制基因表达异常的内在机制,癌基因的激活和抑癌基因的失活为其中两个重要的分子事件。目前,普遍认为DNA甲基化除缺失与突变之外导致基因失活的第三种机制,在肿瘤的发生发展起着不可忽视的作用。由于高甲基化而不表达的抑癌基因,如果能应用去甲基化制剂逆转甲基化异常状态,使之重新表达,理论上即可发挥起抑制肿瘤生长的功能。胃癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一,在我国局各类恶性肿瘤之首。近年来,早期胃癌术后5年生存率已有很大提高,但进展期胃癌术后5年生存率一直没有进一步提高。研究表明,胃癌发生发展是一个多基因参与的多阶段的过程。本实验采用甲基化特异性PCR（MSP）及反转录PCR（RT-PCR）方法探讨5-Aza-dC及TSA对胃癌细胞系中抑癌基因P16和hMLH-1基因甲基化水平和基因表达的影响。本实验为阐明细胞增殖、分化、癌变过程提供线索,并且可能为肿瘤的临床诊断、治疗、预后提供实验依据。方法1、胃癌细胞系培养及5-Aza-dC、TSA干预:细胞接种于含10 mL/L小牛血清（56℃灭活30 min）、100×103U/L青霉素及100×103U/L链霉素的pH7.2的RPMI1640培养液中,在37℃、含5%CO2的湿润空气的恒温密闭式培养箱中培养。分成四组,分别应用5-Aza-dC及TSA干预。（1）加5μmol/L 5-aza-dC培养72小时;（2）加TSA300nmol/L培养24小时;（3）加5μmol/L 5-Aza-dC培养48小时后加TSA300nmol/L继续培养24小时。2、标本的抽提:采用酚/氯仿法抽提基因组DNA,用TRIZOL试剂提取总RNA。3、甲基化特异性PCR:先用亚硫酸氢钠修饰基因组DNA,纯化DNA后使用P16、hMLH-1基因甲基化及非甲基化引物同时进行扩增。4、反转录PCR（RT-PCR）:先将总RNA反转录成cDNA,然后以P16、hMLH-1基因引物进行PCR扩增,同时以GAPDH为内参。5、PCR产物的检测:PCR扩增产物2%琼脂糖凝胶电泳,采用FluorChen V.2.0软件,对图像中的扩增产物条带进行光密度分析,实验重复三次。结果1、胃癌细胞系MKN-45和MGC-803均显示P16、hMLH-1基因启动子区存在高甲基化,其中P16基因在两种胃癌细胞系中均表现为甲基化,hMLH-1基因在胃癌细胞系MGC-803中表现为甲基化而在胃癌细胞系MKN-45中表现为半甲基化。2、MKN-45和MGC-803细胞系经TSA,5-Aza-dC及联合作用后使原来不表达或有弱表达的抑癌基因P16和hMLH-1重新表达或表达增强。3、在5-Aza-dC及TSA的作用下,MKN-45和MGC-803细胞系中P16及hMLH-1基因的甲基化状态得到了逆转。结论P16及hMLH-1基因的异常甲基化是胃癌发生、发展过程中的频繁事件。胃癌细胞系中抑癌基因P16和hMLH-1基因启动子甲基化可能是导致其基因失活的主要原因,5-Aza-dC单独作用和5-Aza-dC及TSA联合应用效果相似,均能显著增强甲基化的肿瘤抑制基因的重新表达。TSA对mRNA表达及DNA甲基化无明显影响。