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玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)是一种常见的霉菌毒素,可对人和动物健康产生严重影响。其主要特点是具有类雌激素样作用,对雌性动物的生殖系统损害极大。此外,还能导致免疫抑制,肝肾损伤,并具有潜在的致癌性。传统的物理和化学脱毒方法有一定的局限性,从微生物中筛选出能降解ZEN的酶成为当前研究热点,但目前对ZEN降解酶基因在真核载体中的表达及对转化产物结构鉴定和对动物脱毒效果的报道较少。前期研究发现,班尼小克银汗霉(Cunninghamella bainieri ATCC 9244B)能使ZEN分子结构上C-3或C-5上的-OH转变为甲氧基,本课题组从自然界真菌中分离得到具有降解ZEN能力的可可毛色二孢菌(Lasiodiplodia theobromae NBRC 31059)和丝层菌寄生(Hypomycessubiculosus ATCC76476),这两种菌株中包含的氧甲基转移酶(Lt-OMT和Hs-OMT)可将ZEN的3-OH和5-OH分别转化为3-OCH3和5-OCH3。本试验从氧甲基转移酶基因酵母异源表达、酵母发酵液转化ZEN、ZEN转化产物纯化、转化产物结构鉴定来评价氧甲基转移酶转化ZEN的能力;通过小鼠体内试验评价ZEN转化产物对小鼠毒性作用,为饲料中霉菌毒素脱毒酶制剂开发提供理论基础。1.构建氧甲基转移酶真核表达载体,酵母异源表达转化ZEN为构建含氧甲基转移酶的人工重组质粒,从NCBI中获得上述两种菌株的氧甲基转移酶(Lt-OMT和Hs-OMT)基因,以质粒pRS425M(+)为表达载体,构建重组质粒,转化感受态大肠杆菌E coli DH5α;经氨苄(Ampicillin,Amp)抗性筛选,挑取单菌落于37℃恒温培养箱振荡培养12-18 h,进行重组质粒的酶切(Nde I和Pme I)鉴定,正确插入的质粒分别命名为 pRS425-307_YEpLeu_HsOMT(307)、pRS425-92_YEpLeu_LtOMT(92)、pRS425-Lt-Hs-OMT_PaeciM(92-307)。正确插入的质粒导入到感受态毕赤酵母中进行异源表达。将10 mg的ZEN加入酵母发酵液中,30℃恒温摇床进行转化,48 h后将发酵液用乙酸乙酯萃取,旋转蒸发仪蒸发,冷冻浓缩,HPLC检测目标产物。试验结果:Lt-OMT基因扩增片段大小为1200 bp,Hs-OMT基因扩增片段大小为1200 bp。酶切92号、92-307号和307号质粒,92号质粒和307号质粒酶切片段大小均为6000 bp和1200 bp,92-307号质粒酶切片段大小为7579 bp、1200 bp和771 bp,与理论上片段大小一致,证明质粒构建成功。ZEN酵母发酵产物经HPLC检测出现新的产物峰,证明三种酶可以将ZEN转化。2.ZEN转化产物纯化、结构鉴定为研究氧甲基转移酶转化ZEN的作用机理,将ZEN转化粗产物用硅胶层析柱进行纯化,收集各馏分,薄层色谱初步确定目标化合物,LC-MS鉴定目标产物分子量,NMR鉴定产物化学结构。试验结果:HPLC分析转化产物,转化产物与ZEN标准品的HPLC图谱相比有新产物峰出现。ZEN标准品和转化后产物保留时间分别为18.443 min、16.808 min、20.123 min、19.353 min。MS扫描分析ZEN和转化产物,分子量分别为317.8(M-H+)、332.8(M-H+)、347.8(M-H+)和332.8(M-H+),与ZEN标准品分子量相比分别增加15、30和15,推测增加成分可能是甲基(-CH3)。经核磁共振1H谱和13C谱以及HMBC图谱,图谱数据解析综合确定转化后的新化合物分别3-OCH3-ZEN,3,5-OCH3-ZEN和5-OCH3-ZEN,证明氧甲基转移酶作用机理是对ZEN中-OH进行氧甲基修饰。3.ZEN转化产物脱毒效果评价为研究氧甲基转移酶转化ZEN的产物脱毒效果,试验选取ICR小鼠60只,随机分成6组:空白对照组(生理盐水)、溶剂对照组(10%乙醇)、ZEN处理组(40 mg/kg)、3-OCH3-ZEN 组(40mg/kg)、3,5-OCH3-ZEN 组(40mg/kg)和 5-OCH3-ZEN 组(40mg/kg)进行腹腔注射,每天1次,连续5 d,末次处理后第2d摘眼球采血并脱颈处死动物,分离肝、肾、脾、子宫、睾丸、卵巢,测定脏器系数;组织切片用于病理学观察;分离得到的血液用于血常规、血生化测定;RT-PCR检测睾丸、卵巢和脾脏细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ、IL-2、TNF-β mRNA 基因表达;Western blot 测定睾丸和子宫中 Bcl-2、Bax、P-P65和P-IκBα蛋白表达水平。结果显示:与对照组相比,ZEN显著地降低了小鼠的体重、卵巢和脾脏脏器指数(P<0.01),增加了肝、肾、子宫、睾丸的脏器指数(P<0.01);血液中白细胞数、淋巴细胞数和中性粒细胞数明显升高(P<0.01),红细胞数和血红蛋白含量显著减少(P<0.01);血清AST、BUN、CREA含量均明显升高(P<0.01),TP、ALB和GLO含量显著降低(P<0.01);ZEN组小鼠肝血窦充血;肾小球皱缩;曲细精管损坏严重;子宫肌层变薄,腺体萎缩;卵巢有较多的闭锁卵泡。细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平均显著升高(P<0.01);IL-2、IFN-γ、TNF-β的基因表达量显著降低(P<0.01)。Western-blot测试表明睾丸和子宫组织的抗凋亡蛋白Bcl-2表达量显著降低(P<0.01),促凋亡蛋白Bax表达量显著升高(P<0.01);NF-κB信号通路P-P65、P-IκBα蛋白表达量显著上升(P<0.01);而同剂量下3-OCH3-ZEN组、3,5-OCH3-ZEN组和5-OCH3-ZEN组小鼠均未见明显的上述病变。以上结果表明,ZEN(40 mg/kg)可导致小鼠较强的毒性作用甚至死亡,而同剂量的转化产物3-OCH3-ZEN、3,5-OCH3-ZEN、5-OCH3-ZEN对小鼠无明显毒副作用,故推测,ZEN转化后产物毒性明显降低,达到了脱毒效果,但高剂量时是否还存在毒性,仍需进一步研究。