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第1章前言糖尿病（Diabetes mellitus,DM）与认知功能障碍密切相关,其中2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus,T2DM）患者较为显著。DM引起的认知功能障碍又称糖尿病脑病（Diabetes encephalopathy,DE）,临床表现主要为学习及记忆功能减退,理解、判断等能力下降。哺乳动物海马区与学习记忆功能关系最为密切,特别是海马CA1区。然而迄今为止,DM相关认知障碍的发病机制仍未阐明。氧化应激在高糖诱导的脑损伤发生发展过程中起到重要作用。长期的氧化应激刺激将导致神经毒性物质通过血脑屏障进入中枢神经系统,进而造成脑损伤。线粒体是一种动态的细胞器,参与众多细胞过程如ATP合成、钙稳态及细胞死亡等。线粒体动力学（线粒体融合和线粒体分裂）是维持正常线粒体形态、质量及功能的重要过程,其中线粒体融合及分裂分别主要由MFN1/2及Drp1介导。大脑的能量供应主要依赖线粒体质量控制,线粒体在维持脑内代谢稳态和调控神经元细胞能量供应、钙离子释放、神经递质运输等方面均发挥重要作用。线粒体动力学的紊乱参与阿尔兹海默症的病理过程,因此,维持线粒体动力学稳定有利于减少海马神经元损伤,对于DE的防治具有重要意义。热休克蛋白22（Heat shock protein 22,HSP22）为小分子热休克蛋白（Small heat shock proteins,s HSPs）成员之一,广泛分布于人体众多器官中,包括心脏、骨骼肌和大脑等。已被证明在氧化应激、炎症、衰老和细胞凋亡等生物学过程中发挥着重要作用。我们的研究团队发现过表达HSP22可以通过抑制炎症和氧化应激来预防糖尿病诱导的内皮细胞损伤及通过抑制炎症、氧化应激及凋亡改善脂多糖诱导的心肌损伤。于是,我们提出假说:高糖状态下,HSP22通过抑制Drp1生成减少海马神经元细胞氧化应激反应和线粒体损伤,最终改善海马神经元细胞损伤。为了证实我们的假说,进行了如下研究:构建糖尿病脑损伤模型,体内实验中沉默HSP22的表达水平、体外实验中过表达及沉默HSP22的表达水平以明确其在高糖诱导海马神经元细胞损伤中的作用。第2章高糖诱导海马损伤、线粒体动力学紊乱及HSP22表达升高目的:探讨高糖状态下海马神经元细胞出现氧化应激反应、线粒体损伤及线粒体动力学紊乱,同时HSP22表达升高。方法:1)普通饲料喂养db/m（对照组）及db/db小鼠（糖尿病组）,每四周进行小鼠体重及空腹血糖测定。2)HE染色、尼氏染色明确各组小鼠海马CA1区损伤情况,免疫组化及免疫荧光定量分析HSP22、Neu N、Aβ的表达水平;Elisa检测各组小鼠海马组织BDNF、NT3表达水平;水迷宫检测各组小鼠认知功能改变。3)DHE及SOD2免疫荧光染色明确高糖诱导海马损伤过程中氧化应激水平及变化;透射电镜及ATP试剂盒检测海马组织中线粒体损伤情况。4)免疫组化检测各组海马组织MFN2及Drp1表达水平。5)构建体外高糖损伤海马神经元细胞（HT22）模型（33.3m M D-葡萄糖）分为三组:对照组（Control,5.5m M D-葡萄糖）、高渗组（OC,33.3m M甘露醇）、高糖组（HG,33.3m M D-葡萄糖）。CCK8试剂盒检测各组细胞活性及WB检测Neu N、Aβ及HSP22的蛋白表达水平。6)线粒体荧光探针mitotracker观察各组HT22线粒体形态变化,ATP检测各组表达水平。7)试剂盒检测细胞上清液中SOD及MDA表达,WB检测蛋白SOD2表达以明确氧化应激水平。8)WB检测各组MFN2及Drp1表达水平。结果:1)db/db组空腹血糖及体重水平均较db/m组明显升高（P＜0.05）,提示糖尿病小鼠模型构建成功。2)HE结果显示db/m组脑组织结构基本正常,海马CA1区神经元细胞排列整齐紧密,胞核清晰,胞质丰富,未见神经元变性。db/db组脑组织结构异常,海马CA1区神经元细胞排列紧密,部分细胞神经元变性,固缩深染。尼氏染色显示与db/m组相比,db/db组尼氏体数量减少。对Neu N行免疫荧光染色发现db/db组Neun表达显著降低（P＜0.05）。3)水迷宫实验发现,与db/m组相比,经过5天训练后db/db组需要更长时间找到水下隐藏的平台;且与db/m组相比,db/db组穿越平台的次数明显减少（P＜0.05）。对Aβ行免疫荧光染色发现db/db组海马CA1区Aβ表达显著增高（P＜0.05）。4)免疫组化显示db/db组海马CA1区HSP22表达水平明显增加（P＜0.05）。5)DHE染色发现db/db组海马组织活性氧水平明显增高（P＜0.05）,对氧化应激相关蛋白SOD2进行免疫荧光染色检测发现db/db组表达水平较db/m组明显降低（P＜0.05）。6)透射电镜显示,db/db组海马线粒体中度水肿、嵴结构不清晰,且线粒体密度显著降低（P＜0.05）。ATP检测发现db/db组海马组织水平较db/m组明显降低（P＜0.05）。7)免疫组化显示db/db组海马CA1区Drp1表达水平较db/m组明显增加（P＜0.05）,MFN2表达无明显改变（P＞0.05）。8)体外实验中,相比Control及OC组,HG组HT22细胞活性及Neu N表达明显降低（P＜0.05）,Aβ表达显著增高（P＜0.05）;HG组诱导HSP22表达显著升高（P＜0.05）。9)HG组HT22细胞线粒体荧光密度及ATP水平较Control及OC组明显降低（P＜0.05）。10)HG组SOD2蛋白表达水平较Control及OC组明显降低（P＜0.05）;对各组细胞上清中SOD及MDA检测发现HG组相比Control及OC组,SOD表达明显降低伴MDA表达明显升高（P＜0.05）。11)WB检测发现HG组Drp1表达水平较Control及OC组明显升高（P＜0.05）,MFN2未见明显改变（P＞0.05）。结论:1)成功构建糖尿病小鼠动物模型;2)长期高糖可诱导海马神经元损伤及小鼠认知功能障碍;3)长期高糖可诱导海马氧化应激水平增加;4)长期高糖可诱导海马线粒体损伤及诱导线粒体动力学紊乱;5)长期高糖可上调海马神经元细胞HSP22表达。第3章HSP22抑制高糖诱导的海马神经元细胞损伤目的:1)证实敲低HSP22加重高糖诱导的海马氧化应激及线粒体损伤,最终加重海马损伤进而影响认知功能。2)证实HSP22可抑制高糖诱导的海马神经元细胞氧化应激及线粒体损伤,进而减轻海马神经元损伤。方法:1)使用神经元特异性启动子h Syn,同时搭载具有特异亲和神经元的血清型PHP.e B,以此实现针对HSP22在神经元中的特异性调控。RT-q PCR检测HSP22m RNA表达水平及应用GFP染色明确病毒感染水平。2)随机分为四组:db/m组、db/db组、db/m+HSP22-sh RNA组及db/db+HSP22-sh RNA组,均予以普通饲料喂养,每四周进行小鼠体重及空腹血糖测定。3)HE染色、尼氏染色明确各组小鼠海马CA1区损伤情况,WB及免疫荧光定量分析HSP22、Neu N、Aβ的表达水平;Elisa检测各组小鼠海马组织BDNF、NT3表达水平;水迷宫检测各组小鼠认知功能改变。4)DHE及SOD2免疫荧光染色明确高糖诱导海马损伤过程中氧化应激水平及变化;透射电镜及ATP试剂盒检测海马组织中线粒体损伤情况。5)免疫组化检测各组海马组织MFN2及Drp1表达水平。6)构建HSP22过表达及沉默慢病毒转染HT22细胞,并给予高糖刺激。具体分组如下:对照组（NG,5.5m M D-葡萄糖）、高糖组（HG,33.3m M D-葡萄糖）、高糖组+HSP22过表达组（HG+OE-HSP22,33.3m M D-葡萄糖）、高糖组+HSP22过表达对照组（HG+OE-NC,33.3m M D-葡萄糖）、高糖组+HSP22沉默组（HG+Si RNA-HSP22,33.3m M D-葡萄糖）、高糖组+HSP22沉默对照组（HG+Si RNA-NC,33.3m M D-葡萄糖）。RT-q PCR检测HSP22表达水平,CCK8检测各组细胞活性及免疫荧光检测Neu N、Aβ表达水平。7)线粒体荧光探针mitotracker观察各组HT22线粒体形态变化,ATP检测各组表达水平。8)试剂盒检测细胞上清液中SOD及MDA表达,免疫荧光检测蛋白SOD2表达以明确氧化应激水平。9)免疫荧光检测各组MFN2及Drp1表达水平。结果:1)与对照组相比,处理组GFP荧光强度明显增高;HSP22转录水平较对照组明显改变。2)与db/db组相比,db/db+HSP22-sh RNA组空腹血糖及体重水平无明显差异（P＞0.05）;db/m组与db/m+HSP22-sh RNA组之间空腹血糖及体重水平无明显差异（P＞0.05）。3)与db/db组相比,db/db+HSP22-sh RNA组脑组织结构重度异常,海马CA1区大部分细胞神经元变性,固缩深染;db/m+HSP22-sh RNA组未见明显结构异常。尼氏染色提示db/db+HSP22-sh RNA组尼氏体较db/db组进一步减少。Neu N免疫荧光检测发现db/db+HSP22-sh RNA组表达相较于db/db组明显降低（P＜0.05）。4)水迷宫实验发现与db/db组相比,db/db+HSP22-sh RNA组需要更长时间找到水下隐藏的平台且穿越平台的次数较db/db组明显减少（P＜0.05）。db/db+HSP22-sh RNA组Aβ表达水平较db/db组显著增高（P＜0.05）。5)db/db+HSP22-sh RNA组海马组织活性氧水平较db/db组明显升高（P＜0.05）,且SOD2表达水平较db/db组进一步降低（P＜0.05）。6)透射电镜结果发现,db/db+HSP22-sh RNA组海马组织中线粒体高度肿胀、空泡化,未见线粒体嵴结构。与db/db组相比,线粒体密度及ATP水平均明显降低（P＜0.05）。7)db/db+HSP22-sh RNA组海马CA1区Drp1表达水平较db/db组明显升高（P＜0.05）,两组MFN2无明显改变（P＞0.05）。8)体外实验中,HG+OE-HSP22组较HG+OE-NC组细胞活性及Neu N表达水平明显升高,Aβ表达显著降低（P＜0.05）;HG+Si RNA-HSP22组较HG+Si RNA-NC组细胞活性及Neu N表达水平显著降低,Aβ表达显著升高（P＜0.05）。9)HG+OE-HSP22组线粒体荧光密度及ATP水平较HG+OE-NC组明显升高（P＜0.05）;HG+Si RNA-HSP22组与HG+Si RNA-NC组呈相反趋势（P＜0.05）。10)HG+OE-HSP22组SOD2蛋白表达水平较HG+OE-NC组明显升高（P＜0.05）;对各组细胞上清中SOD及MDA检测发现相比HG+OE-NC组,HG+OE-HSP22组SOD表达明显升高伴MDA表达明显降低（P＜0.05）。然而,HG+Si RNA-HSP22组与HG+Si RNA-NC组对比呈相反趋势（P＜0.05）。11)免疫荧光检测发现HG+OE-HSP22组Drp1表达水平较HG+OE-NC组明显降低（P＜0.05）,HG+Si RNA-HSP22组较HG+Si RNA-NC组表达水平明显升高（P＜0.05）;MFN2未见明显改变（P＞0.05）。结论:1)糖尿病小鼠模型中,敲低HSP22加重海马氧化应激及线粒体损伤,进而导致海马损伤最终影响认知功能;2)高糖状态下,过表达HSP22可抑制海马神经元细胞氧化应激及线粒体损伤;3)沉默HSP22加剧高糖诱导的海马神经元细胞线粒体动力学紊乱,过表达HSP22可改善高糖诱导的海马神经元细胞线粒体动力学紊乱。第4章HSP22通过抑制高糖介导Drp1产生减轻海马神经元细胞损伤目的:探讨HSP22是否通过抑制Drp1生成改善高糖诱导海马神经元细胞氧化应激反应及线粒体损伤。方法:1)构建HSP22沉默慢病毒转染HT22,并给予高糖及Mdivi-1处理。根据实验分为四组:高糖组（HG,33.3m M D-葡萄糖）、高糖组+Mdivi-1组（HG+Mdivi-1,33.3m M D-葡萄糖）、高糖组+HSP22沉默组（HG+Si RNA-HSP22,33.3m M D-葡萄糖）、高糖组+HSP22沉默+Mdivi-1组（HG+Si RNA-HSP22+Mdivi-1,33.3m M D-葡萄糖）。免疫荧光检测Drp1、Neun、Aβ表达水平。2)线粒体荧光探针mitotracker观察各组海马神经元细胞（HT22）线粒体形态变化,ATP检测各组表达水平。3)试剂盒检测细胞上清液中SOD及MDA表达,免疫荧光检测蛋白SOD2表达以明确氧化应激水平。结果:1)与HG组相比,HG+Mdivi-1组Neu N表达水平明显升高（P＜0.05）;与HG+Si RNA-HSP22组相比,HG+Si RNA-HSP22+Mdivi-1组Neu N表达水平明显升高（P＜0.05）。与HG组相比,HG+Mdivi-1组Drp1及Aβ表达水平明显降低（P＜0.05）;与HG+Si RNA-HSP22组相比,HG+Si RNA-HSP22+Mdivi-1组Drp1及Aβ表达水平明显降低（P＜0.05）。2)HG+Mdivi-1组线粒体荧光密度及ATP水平较HG组明显升高（P＜0.05）;HG+Si RNA-HSP22+Mdivi-1组与HG+Si RNA-HSP22组比较呈相同趋势（P＜0.05）。3)HG+Mdivi-1组SOD2蛋白表达水平较HG组明显升高（P＜0.05）,对各组细胞上清中SOD及MDA检测发现HG+Mdivi-1组SOD表达明显升高伴MDA表达明显降低（P＜0.05）。HG+Si RNA-HSP22+Mdivi-1组与HG+Si RNA-HSP22组比较呈相同的趋势（P＜0.05）。结论:1)HSP22通过抑制Drp1改善高糖环境下海马神经元细胞氧化应激反应及线粒体损伤;2)高糖状态下,Mdivi-1可缓解HSP22缺乏诱导的海马神经元细胞Drp1生成及线粒体损伤。第5章总结本研究中,我们证实在高糖环境下HSP22通过抑制海马神经元细胞氧化应激及线粒体损伤,最终改善海马损伤及认知功能。此外,HSP22可通过抑制Drp1生成改善海马神经元细胞氧化应激反应及线粒体损伤,进而保护海马神经元细胞。总之,我们在本研究中探索了HSP22在高糖诱导海马神经元损伤中的作用及其分子机制,将为糖尿病脑病的防治提供新的思路及新的靶点。