背景与目的根据世界卫生组织2014年发布的最新统计,肺癌无论是发病率还是致死率均居世界各种癌症的首位,给人类的健康造成极大威胁。近年来,虽然针对肺癌的治疗有了长足发展,但是这些治疗措施仍不能从根本上提高患者的五年生存率。因此,人们在不断探寻肺癌治疗的新靶点和治疗方法,以期待能改善患者的总体生存期。近年来,肺癌治疗的进展最为突出的集中在针对肺腺癌驱动基因的分子靶向药物的研发和应用,而占据肺癌总体约25%的肺鳞癌却没有明显的进展。因此寻找肺鳞癌驱动基因就成为一项非常迫切的任务。盘状结构域受体2(discoidin domain receptor2,DDR2)是一种受体酪氨酸激酶,其配体是细胞外基质中最为丰富的胶原。因此参与了细胞与细胞外基质间的信息交流,促进骨骼的发育,生殖细胞的产生和排出,脂肪代谢,上皮细胞的极性维持,细胞分化和存活等多项重要的功能。最新研究发现DDR2在肺鳞癌患者中存在突变并且对已经上市的小分子酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼(Dasatinib)敏感,可能成为潜在靶向治疗的驱动基因。由于既往表皮生长因子受体(EGFR)突变率存在人种的差异,关于DDR2是否存在人种差异以及在中国人目前没有相应的研究,因此设计了该研究,并试图回答上述问题。材料与方法1.搜集手术切除的肺鳞癌患者石蜡标本中的DNA,利用PCR方法扩增DDR2基因,送华大基因公司利用sanger测序法检测DDR2外显子的DNA的序列,利用NCBI数据库,比对测序结果,判断DDR2基因突变位点。2.利用pEGFP-N1质粒,构建含DDR2新突变位点的全长蛋白编码序列的质粒载体。将构建的pEGFP质粒转染入HBE, SK-MES-1,NCI-H1703细胞,荧光显微镜观察、评估转染效率。利用MTT方法对比研究外源性过表达DDR2突变基因的3种细胞的增殖生长曲线；利用平板克隆形成实验对比研究外源性过表达DDR2突变基因的细胞克隆形成的差异；划痕实验直观观察外源性过表达DDR2突变基因的细胞迁移能力的改变；利用Transwell实验,在有／无Matrigel基质胶的条件下定量分析细胞的迁移和侵袭能力的改变。3.G418筛选稳定表达DDR2突变基因的NCI-H1703细胞,并将细胞植入BALB/c裸鼠中构建皮下肿瘤模型,每只裸鼠皮下种植5×106个细胞,每3天测量肿瘤的大小。注射15天后处死裸鼠观察肿瘤生长情况,通过测量肿瘤组织的最大径a及最小径b,根据体积=ab2/2公式计算得出每组肿瘤的大小；并进行肿瘤组织重量的测量,最后统计分析。利用免疫组织化学检测Ki67表达,判断体内肿瘤的增殖情况。4.利用荧光定量PCR和western blot方法,检测上皮、间质细胞标志性分子、EMT标志蛋白(E钙粘蛋白和N钙粘蛋白)的表达和基底膜IV胶原酶基质金属蛋白酶(MMP-2和MMP-9)的表达,分析DDR2突变基因驱动肿瘤生长、迁移、侵袭的可能机制。结果1.在86例中国人肺鳞癌患者中发现4例患者DDR2基因外显子的3个错义点突变。本实验对135例肺鳞形细胞癌患者石蜡标本进行了基因组DNA提取,结果有86例患者的基因组DNA可以对DDR2基因进行PCR扩增,经过sanger法测序,并将结果与NCBI数据库DDR2基因外显子序列进行对比,共发现了4例患者在DDR2基因外显子的3个位点上发生了错义点突变：S131C, G531V, T681I;同时也发现了7例患者在4个位点发生了同义点突变：L100L, H136H, G502G, H520H;28例患者在13号外显子前(内含子)的第20位碱基T/C杂合。2.过表达DDR2S131C点突变的细胞的增殖、迁移和侵袭能力增加明显。将载有pEGFP-DDR2, pEGFP-DDR2-S131C, pEGFP-DDR2-T681I质粒与空白对照质粒pEGFP-N1转染HBE, SK-MES-1, NCI-H1703细胞,构建DDR2基因过表达细胞株。荧光显微镜观察过绿色荧光表达满意后,利用MTT法和平板克隆计数法,对3种细胞的生长曲线和克隆数的对比分析发现,过表达DDR2S131C点突变的细胞较转染pEGFP-N1, pEGFP-DDR2, pEGFP-DDR2-T681I细胞的增殖能力强和克隆形成数多。利用划痕和transwell实验发现过表达DDR2S131C点突变的细胞较其它细胞的迁移和侵袭的能力强。3.过表达DDR2S131C点突变的细胞在裸鼠体内具有较强的成瘤能力。利用裸鼠体内成瘤实验,对比过表达pEGFP-N1, DDR2野生型,DDR2S131C点突变肺鳞癌细胞形成的肿瘤体积、重量,发现DDR2S131C点突变癌细胞形成的肿瘤均较空白对照组、DDR2野生型大。免疫组织化学分析,过表达DDR2S131C点突变的肿瘤Ki67阳性细胞数多。4.过表达DDR2S131C点突变的细胞E钙粘蛋白表达下降,MMP-2分泌增加明显。利用qRT-PCR和western blot方法,对过表达pEGFP-N1, pEGFP-DDR2, pEGFP-DDR2-S131C, pEGFP-DDR2-T6811基因的细胞进行分析发现,过表达S131C点突变的癌细胞E钙粘蛋白表达明显降低,MMP-2表达增加。结论与意义1.中国人肺鳞癌患者DDR2基因突变率为4.6%,与文献报道的欧美人群总体突变率无差异。本实验中86例肺鳞癌患者共有4例患者发生了DDR2基因突变,与文献报道的欧美人群以及中国人群无差异,将所有报道的DDR2突变位点汇总分析,提示DDR2基因突变具有随机性,没有集中区,可能成为将来大规模筛查突变患者的障碍。2. DDR2S131C错义点突变具有促细胞增殖、成瘤和转移的能力,至少部分机制与E钙粘蛋白表达下降,MMP-2分泌增加相关。DDR2S131C功能获得性突变可以成为潜在的治疗靶点。通过绘制生长曲线、平板克隆、划痕和transwell实验证实S131C点突变具有更强的促增殖、迁移和侵袭能力。通过qRT-PCR和western blot分析,DDR2S131C基因突变的促增殖、迁移和侵袭机制至少部分与E钙粘蛋白表达下降,MMP-2分泌增加相关。提示DDR2基因突变可以改变细胞蛋白的表达,影响细胞功能,这种功能获得性驱动突变可以成为潜在的治疗靶点。3.DDR2T681I突变无功能获得性突变特征,提示不是所有的DDR2突变均可成为治疗的靶点。在体外实验中,DDR2T681I点突变在细胞中过表达后,无论是细胞增殖,还是细胞迁移、侵袭实验中,均未能表现出较过表达空白、DDR2野生型对照的优势,至少在本实验中,未能证实T681I突变具有功能获得性突变的特征,提示将来在患者中发现DDR2突变,并不意味着其可能从分子靶向药物中获益。