赭曲霉毒素A（Ochratoxin A,OTA）主要是由曲霉和青霉产生的次级代谢产物,主要污染粮谷类、咖啡、中草药、葡萄及葡萄酒等农作物及食品。研究表明,OTA对人类及动物都具有肝肾毒性、致癌和致突变等作用,是目前对人类及动物最具威胁的真菌毒素之一。因此,对OTA建立高灵敏度、快速简便的检测方法意义重大。本研究从两个方向着手,致力于提高检测方法的灵敏度。一是结合新型信号放大方式构建检测OTA的酶促免疫传感方法;二是对抗OTA纳米抗体进行体外亲和成熟,提高纳米抗体的亲和力。主要研究如下:1. 钙黄绿素可与Ce³⁺结合形成络合物,其荧光发生猝灭;当Ce³⁺与PO₄^3-结合产生Ce PO₄时,钙黄绿素从络合物中解离,其荧光发生复性。利用钙黄绿素与PO₄^3-竞争结合Ce³⁺的原理,构建磷酸盐触发荧光免疫传感系统。通过优化免疫传感系统中各参数,如抗原浓度、抗体浓度、甲醇浓度、竞争反应时间、p H值和离子强度,建立了基于纳米抗体-碱性磷酸酶融合蛋白（Nb-AP）检测OTA的磷酸盐触发荧光免疫分析法。该方法的线性范围为0.19-1.26 ng/m L,IC₅₀为0.46 ng/m L,LOD为0.12ng/m L。通过加标回收实验结合HPLC-FLD方法,证明Nb-AP介导的PT-FIA方法准确可靠,适用于食品和环境中痕量污染物的检测。2. 纳米抗体（Nanobody,Nb）是当前已知尺寸最小的基因工程抗体,具有稳定性高、水溶性好等优点,同时其结构简单,易于体外亲和成熟。本研究以抗OTA的纳米抗体Nb28为对象,通过SWISS-MODEL对Nb28进行建模,获得其三维结构模型。在对其结构进行能量最小化后,使用Autodock4.2将其与OTA分子进行模拟对接,初步预测Nb28与OTA结合的关键氨基酸位点。经丙氨酸扫描后,通过ELISA检测突变子的亲和力的变化,最终确定Nb28与OTA结合的4个关键氨基酸位点,分别为Gly53、Met79、Ser102和Leu149。3. 经同源建模、分子对接和丙氨酸扫描确定纳米抗体Nb28与OTA的四个关键氨基酸位点后,将上述四个关键氨基酸位点进行两两配对,并构建53G&102S-m Lib和79M&149L-m Lib两个随机突变文库。以OTA-BSA为靶标,经4轮生物淘选后,获得亲和力更高的纳米抗体突变子Nb-G53Q&S102D,其IC₅₀为0.29 ng/m L,KD值为52 n M,分别比Nb28低1.4倍和1.36倍。本研究首次对免疫库筛选获得的纳米抗体进行体外亲和成熟,结合筛选结果及模拟仿真发现,氨基酸残基的极性、疏水相互作用和侧链空间位阻对于抗体与抗原相互作用至关重要,研究结果对纳米抗体的体外亲和成熟具有一定的参考价值。