论文部分内容阅读
第一部分 SAH后脑组织中PK2、A1和A2型星形胶质细胞标记蛋白水平变化目的:探究大鼠蛛网膜下腔出血（Subarachnoid hemorrhage,SAH）不同时间点和临床SAH患者脑组织中前动力蛋白2（Prokineticin-2,PK2）、A1及A2型星形胶质细胞（Astrocyte,AS）内标记蛋白水平变化。方法:1.实验分组:①96只雄性SD大鼠随机分为8组,Sham组和SAH后3 h、6 h、12 h、24 h、48 h和168 h组。②回顾分析20例临床脑组织样本,其中10例为Non-SAH组,10例为SAH组。2.大鼠SAH活体模型通过往视交叉前池注入300 μ1自体心脏穿刺动脉血建立。3.利用Western blot技术检测大鼠脑组织中PK2、A1型AS标记蛋白（C3、Serping1）及A2型AS标记蛋白（PTX3、S100A10）水平变化;通过免疫荧光共染技术来观察PK2、C3、PTX3在脑组织中的定位及水平变化。结果:1.大鼠SAH后脑组织中PK2蛋白水平波动上升,于12h达到峰值（P＜0.01）,随后蛋白水平逐渐下降。2.大鼠SAH后脑组织中C3蛋白水平明显上升,于SAH后的12 h达到峰值（P＜0.01）,并持续高表达到168 h（P＜0.05）;Serping1在SAH后的3 h蛋白水平明显升高（P＜0.05）,随后蛋白水平下降;PTX3在SAH后蛋白水平明显上升,于12h达到峰值（P＜0.005）;S100A10蛋白水平SAH后波动上升,在24 h达峰值（P＜0.05）,随后蛋白水平下降。免疫荧光表明,A1型标记蛋白C3和A2型标记蛋白PTX3共同定位在AS上,且两个标记蛋白含量增加,荧光强度明显增强（P＜0.05）。3.临床标本结果表明,SAH组较Non-SAH组PK2在神经元中蛋白水平明显上升（P＜0.05）;C3及PTX3定位在AS上,SAH组较Non-SAH组C3及PTX3蛋白水平明显上升（P＜0.05）。结论:1.大鼠SAH后神经元合成PK2增多,SAH后A1和A2型AS都被激活,但A1型AS激活时间更持久。2.SAH后人脑组织中神经元合成PK2增多,同时A1和A2型AS标记蛋白也明显增高。第二部分PK2在大鼠SAH模型中调控星形胶质细胞表型转化及机制研究目的:探究PK2在大鼠SAH模型中调控AS表型的转化及对早期脑损伤（Early brain injury,EBI）的影响。方法:1.实验分组:雄性SD大鼠（共108只）随机分为6组（每组18只）,分别为Sham组、SAH组、小干扰RNA阴性对照组（SAH+Si-NC组）、PK2小干扰RNA组（SAH+Si-PK2 组）、rPK2 空载对照组（SAH+Vehicle 组）、给予 rPK2 组（SAH+rPK2 组）。2.在SAH模型建立后12 h,随机选取存活的6只大鼠全麻后处死,并收集脑组织分别用于Western blot、免疫荧光染色检测PK2、A1型标记蛋白C3和A2型标记蛋白PTX3。剩余的存活的12只大鼠在蛛网膜下腔出血后48h用于神经功能缺陷评分,分成两组其中6只被处死后行FJC、TUNEL和Cleaved caspase 3检测;剩余6只在第4-7天继续行转轮试验以及水迷宫试验。结果:1.SAH组与Sham组相比大鼠脑组织中PK2蛋白水平明显升高（P＜0.01）;敲低PK2后,PK2蛋白水平明显降低（P＜0.05）;给予rPK2过表达后,PK2的蛋白水平明显升高（P＜0.05）。2.SAH后脑组织C3及PTX3蛋白水平明显增加;SAH+Si-PK2组与对照组相比,C3蛋白水平显著增加（P＜0.05）,PTX3蛋白水平显著减少（P＜0.05）;SAH+rPK2组与对照组相比,C3蛋白水平显著减少（P＜0.05）,PTX3蛋白水平显著增加（P＜0.05）。免疫荧光结果:SAH后A1及A2型标记蛋白的含量明显增加且共同定位在星形胶质细胞上,SAH+Si-PK2组较对照组中C3蛋白水平显著上升,PTX3蛋白水平显著降低（P＜0.05）;SAH+rPK2组较对照组中C3蛋白水平显著减少（P＜0.05）,PTX3蛋白水平显著增加（P＜0.05）。SAH后脑组织中STAT3的磷酸化水平明显增加;SAH+Si-PK2组与SAH+Si-NC组相比STAT3磷酸化水平降低（P＜0.05）;SAH+rPK2组与SAH+Vehicle组相比STAT3磷酸化水平明显升高（P＜0.05）。3.SAH后大鼠脑组织中活化的Caspase3蛋白水平显著升高（P＜0.05）;敲低PK2后,活化的caspase3的蛋白水平显著升高（P＜0.05）。给予rPK2干预后,活化的caspase3的蛋白水平显著降低（P＜0.05）。TUNEL结果:SAH组大鼠脑组织中细胞凋亡数量显著增多（P＜0.01）;SAH+Si-PK2组较对照组细胞凋亡细胞数量显著增多（P＜0.05）,SAH+rPK2组较对照组细胞凋亡数量显著减少（P＜0.05）。FJC结果:SAH组大鼠脑组织中神经元退行性变数量显著增多（P＜0.01）;SAH+Si-PK2组较对照组神经元退行性变数量显著增多（P＜0.05）,SAH+rPK2组较对照组神经元退行性变数量显著减少（P＜0.05）。4.大鼠在SAH后神经功能缺陷评分显著升高（P＜0.001）,敲低PK2后,导致大鼠的神经功能缺陷评分进一步升高（P＜0.05）;相反当给予rPK2干预后,神经功能缺陷评分显著降低（P＜0.05）。转轮试验:SAH后大鼠在转棒上停留时间明显缩短（P＜0.001）;SAH+Si-PK2组与对照组相比,大鼠在转棒上停留时间显著缩短（P＜0.05）。SAH+rPK2组与对照组相比,大鼠在转棒上停留时间显著延长（P＜0.05）。水迷宫:SAH后大鼠抵达水迷宫中浸没平台所需时间显著增加（P＜0.001）;SAH+Si-PK2组与对照组相比,大鼠抵达水迷宫中浸没平台所需时间显著增加（P＜0.01）。SAH+rPK2组与对照组相比,大鼠抵达水迷宫中浸没平台所需时间显著减少（P＜0.01）。结论:1.PK2可以有效改善SAH后神经元的凋亡、退行性变以及神经功能损伤,促进大鼠的运动记忆以及学习能力的恢复。2.PK2可能通过STAT3磷酸化调控A2型AS的生成,减少了炎症因子的释放,从而发挥了缓解SAH后EBI的作用。第三部分 PK2在体外SAH炎症模型中调控星形胶质细胞表型转化及机制研究目的:探究体外SAH炎症模型中神经元刺激后PK2的蛋白水平及PK2对AS表型转化的影响及机制研究。方法:1.将培养的神经元分为三组:Control组、TNF-α+Vehicle组和TNF-α组。通过免疫荧光染色探究通过TNF-α刺激后神经元PK2蛋白水平变化,并应用ELISA法测定培养基中PK2含量。2.用TNF-α模拟SAH后炎症反应激活AS,将培养的AS分为6组:Control组,TNF-α-Vehicle 组（Vehicle-1 组）,TNF-α 组,TNF-α+Vehicle-PK2 组（Vehicle-2 组）,TNF-α+rPK2组。通过Western blot、免疫荧光染色检测A1型及A2型标记蛋白的水平变化,并通过Western blot进一步分析体外实验中的分子机制。结果:1.TNF-α组较对照组神经元内PK2蛋白水平明显上升（*P＜0.05）,培养基中分泌的PK2蛋白含量也明显上升（****p＜0.001）。2.Vehicle-1组与Contro1组相比无统计学差异;TNF-α组较Vehicle-1组中C3及PTX3蛋白含量都显著增加（P＜0.05）;rPK2组较Vehicle-2组相比C3的蛋白含量显著减低（P＜0.05）,PTX3蛋白含量显著增加（P＜0.05）。免疫荧光示:TNF-α组较Vehicle-1组,胞体肥大,胞体内A1型标记蛋白C3和A2型标记蛋白PTX3含量明显升高,而rPK2组较Vehicle-2组中C3蛋白含量显著降低（P＜0.05）,PTX3蛋白含量显著增加（P＜0.05）。3.TNF-α组较Vehicle-1组中P65及p-STAT3蛋白的蛋白含量都显著增加（P＜0.05）,而rPK2组较Vehicle-2组中P65的蛋白含量显著减低（P＜0.05）,p-STAT3的蛋白含量显著增加（P＜0.05）。结论:1.TNF-α刺激神经元合成及分泌PK2蛋白。2.TNF-α可以激活AS,而过表达PK2可以减少A1型AS生成,促进A2型AS生成。3.STAT3与P65可能参与AS表型之间的转换,p-STAT3可能与A2型有关,P65可能与A1型有关。